驱动蛋白KIF4A抑制胃癌细胞的侵袭作用

冀美超 姜虹羽 董智雄 朱长军

300387天津师范大学生命科学学院，天津市动植物抗性重点实验室，天津师范大学分子细胞系统生物学重点实验室

驱动蛋白KIF4A抑制胃癌细胞的侵袭作用

冀美超 姜虹羽 董智雄 朱长军

300387天津师范大学生命科学学院，天津市动植物抗性重点实验室，天津师范大学分子细胞系统生物学重点实验室

目的应用胃癌细胞SGC-7901以及稳定低表达驱动蛋白KIF4A的胃癌细胞SGC-shKIF4A，研究KIF4A对胃癌细胞侵袭能力的作用。方法使用蛋白免疫印迹法鉴定对照胃癌细胞SGC-shNC以及SGC-shKIF4A细胞内KIF4A蛋白的表达水平，并通过细胞侵袭实验计数这两种细胞的侵袭能力。通过细胞免疫荧光染色法观察在SGC-7901、SGC-shNC、SGC-shKIF4A细胞中皮层肌动蛋白（cortactin）的数量变化情况。结果与对照细胞SGC-shNC相比，SGC-shKIF4A细胞侵袭能力明显增强；与其他细胞相比，SGC-shKIF4A细胞的cortactin数量明显增多（P＜0.01），表明该细胞内侵袭性伪足增多。结论驱动蛋白KIF4A具有抑制胃癌细胞的侵袭作用，这为KIF4A作为靶点应用于胃癌的预后预测以及有效治疗奠定理论基础。

KIF4A；皮层肌动蛋白；细胞侵袭；胃癌细胞

Fund program:General Program of National Natural Science Foundation of China(31271485)；Program for New Century Excellent Talents in University in China(NCET-11-1066);National Natural Science Foundation for Young Scientists of China(31301138);Tianjin Science and Technology of Small and Medium-sized Enterprise Technology Innovation Fund(14ZXCXSY00121)

0 引言

肿瘤是类常见多发疾病，其中恶性肿瘤是威胁人类健康最严重的疾病之一。我国现有癌症患者300多万，每年死于恶性肿瘤的患者约为130万。胃癌是全球最常见的消化道恶性肿瘤之一，我国及日本、韩国是胃癌高发区。我国每年新发病例约40万例，占世界总发病例数的42%[1]。胃癌在我国恶性肿瘤中的发病率和病死率均居首位[2]。研究发现，90%以上的恶性肿瘤患者最终死于肿瘤转移或复发。众所周知，侵袭性和远端转移的特性是恶性肿瘤最主要的生物学特性，也是恶性肿瘤难以根治的主要原因。因此，研究调控肿瘤细胞侵袭能力的具体分子机制，建立有效的阻断方式具有重要的临床实践指导价值。

染色体驱动蛋白分子KIF4A参与细胞有丝分裂过程中纺锤体的形成[3]、染色体的凝集与分离[4]、脑神经元的发育与再生[5]、DNA的损伤应答[6]、免疫细胞的活化[7]、细胞骨架微管动态不稳定性（microtubule dynamicinstability）的调控[8]及细胞内的大分子运输[9]等。早期研究发现，KIF4A蛋白与胃癌细胞的发生发展以及胃癌的转移相关[10-12]，但KIF4A蛋白对胃癌细胞侵袭能力的影响研究尚无报道。为此，笔者采用对照胃癌细胞SGC-shNC及稳定低表达KIF4A胃癌细胞SGC-shKIF4A为实验模型，研究KIF4A蛋白对胃癌细胞侵袭能力的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

RPMI1640培养基（美国Gibco公司），胎牛血清（美国Hyclone公司），遗传霉素（G418）（德国Calbiochen公司），特异性多克隆兔抗KIF4A抗体（天津师范大学分子细胞系统生物学重点实验室自制），特异性单克隆鼠抗微管蛋白（tubulin）抗体（美国Sigma公司），特异性单克隆鼠抗皮层肌动蛋白（cortactin）抗体（美国Millipore公司），荧光标记或辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗和4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI）（美国Invitrogen公司），胃癌细胞SGC-7901（美国ATCC），对照细胞株SGC-shNC和KIF4A稳定低表达胃癌细胞系SGC-shKIF4A1、SGC-shKIF4A2、SGC-shKIF4A3（天津师范大学分子细胞系统生物学重点实验室构建）[13]，Transwell小室（北京优尼康生物科技有限公司），基质胶（matrigel）（美国BD Biosciences公司）。TS-100FL倒置荧光显微镜（日本Nikon公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

SGC-7901细胞用含体积分数为10%胎牛血清的RPMI1640培养基，SGC-shNC、SGC-shKIF4A1、SGC-shKIF4A2和SGC-shKIF4A3细胞均用含体积分数为10%胎牛血清、质量浓度为0.1 mg/ml G418的RPMI1640培养基，于37℃、5%CO2培养箱中培养，采用含质量浓度为0.2 g/L EDTA的胰酶消化细胞并进行传代。

1.2.2 鉴定各细胞的KIF4A蛋白表达量

分别收集1×105个SGC-shNC、SGC-shKIF4A1、SGC-shKIF4A2、SGC-shKIF4A3细胞，用全细胞裂解液（质量浓度为20 g/L十二烷基硫酸钠（SDS），体积分数为10%的甘油，50 mmol/L Tris-Cl，体积分数为1%的β-巯基乙醇，质量浓度为0.4 g/L的溴酚蓝）裂解细胞；取适量的细胞裂解液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、转膜至聚偏氟乙烯膜；用质量浓度为50 mg/ml的脱脂奶粉/Tris缓冲盐溶液（Tris-buffer saline,TBS）封闭1 h，然后加入质量浓度为30 mg/ml的脱脂奶粉/TBST（TBS+吐温20）孵育一抗2 h或4℃过夜，再加入对应的二抗杂交；洗膜后加入ECL及H2O2（体积比为1 000∶1）的混合液中孵育2 min，曝光。

1.2.3 细胞侵袭实验

在6 cm细胞培养皿中分别种入适量的SGC-shNC、SGC-shKIF4A1、SGC-shKIF4A2、SGC-shKIF4A3细胞，于37℃、5%CO2培养箱中培养24 h；待细胞完全贴壁正常生长后，对细胞进行饥饿培养24 h；在进行饥饿处理的同时，在Transwell小室的上室铺100 μl体积分数为2%的基质胶（基质胶用无血清无抗生素的RPMI1640培养基配制），将铺好基质胶的Transwell小室放于37℃、5%CO2培养箱中；将细胞饥饿处理24h后，采用含质量浓度为0.2g/LEDTA的胰酶消化细胞，用含体积分数为10%胎牛血清的培养基终止胰酶反应，800 r/min离心3 min，弃去培养基；加入1 ml无血清无抗生素的培养基将细胞吹匀，用血球计数板计数5×104个细胞接种于Transwell小室上室中，向下室中加入800μl含体积分数为30%胎牛血清的RPMI1640培养基，放入37℃、5%CO2培养箱中培养10~24h；弃去Transwell小室上室的培养基，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline,PBS）洗Transwell小室上下部两次，每次5min；弃去PBS，棉签轻轻擦去Transwell小室上室的细胞；下室加入800 μl甲醇固定10 min，弃去甲醇；用质量浓度为10 g/L的伊红染色5 min，弃去伊红，PBS洗小室1次，每次5 min；刀片切下小室的膜，铺展在载玻片上，于显微镜下观察。

1.2.4 细胞免疫荧光观察

向铺有细胞爬片的24孔板中每孔接种3×104个细胞，于37℃、5%CO2培养箱中培养24 h；取出爬片，每孔用500 μl PBS洗3次，每次5 min，弃去PBS；用500 μl体积分数为4%的福尔马林固定液固定细胞15min，弃去固定液，用500μlPBS洗3次，每次5 min；加入含有0.1 mol/L甘氨酸的PBS终止固定反应；取出爬片，加100 μl封闭液（体积分数为10%山羊血清，体积分数为0.4%TritonX-100，1×PBS）封闭30 min，弃去封闭液；加入100 μl PBS-TX（含体积分数为0.1%Triton X-100的PBS）洗3次，每次5 min，弃去PBS-TX；加入100 μl PBS-TX稀释的一抗稀释液（体积比为1∶1 000）室温孵育2 h；一抗孵育完成后，加入100 μl PBS-TX洗3次，每次5 min；加入100 μl PBS-TX稀释的二抗稀释液（体积比为1∶1 000）室温避光孵育1 h，弃去二抗稀释液；加入50 μl PBS-TX稀释的DAPI（1 μg/ml）染色5 min，弃去DAPI；加入100 μl PBS-TX洗3次，每次5 min，弃去PBS-TX；在载玻片上滴加5 μl抗淬灭剂，将爬片细胞面朝向抗淬灭剂放在载玻片上，吸取多余液体，用指甲油封片，于荧光显微镜下观察。

1.3 统计学方法

采用SPSS17.0软件进行统计学分析，实验数据以均数±标准差（x±s）表示，应用单因素方差分析进行组间比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Western Blot及Scion Image软件比较短发夹RNA稳定表达细胞株中KIF4A蛋白含量

由图1A可知，笔者所在实验室构建的4种细胞株中，KIF4A蛋白质的表达量存在明显不同。SGC-shNC细胞作为对照细胞，其KIF4A蛋白的含量明显高于3种KIF4A短发夹RAN（shRNA）稳定表达的SGC-shKIF4细胞株。应用Scion Image图像分析软件对图1A中的蛋白条带进行定量分析，以SGC-shNC细胞内KIF4A与tubulin含量的比值为1，SGC-shKIF4A1、SGC-shKIF4A2和SGC-shKIF4A3细胞内KIF4A与tubulin含量的比值分别是0.208± 0.015、0.263±0.079、0.399±0.145（图1B）。统计学分析结果表明，SGC-shNC与SGC-shKIF4A1、SGC-shKIF4A2、SGC-shKIF4A3细胞株中KIF4A蛋白含量间差异均有统计学意义（P＜0.01），而SGC-shKIF4A1、SGC-shKIF4A2和SGC-shKIF4A3细胞株中KIF4A蛋白含量间差异均无统计学意义（P＞0.05）。综上所述，SGC-shKIF4A细胞株中KIF4A蛋白的含量明显降低，可用于KIF4A对不同细胞侵袭能力影响的研究。

2.2 细胞侵袭实验

KIF4A是一种染色体结合驱动蛋白分子，其功能多样，并与很多人类重大疾病的发生发展密切相关。前期研究工作发现，KIF4A与胃癌的发生发展及转移相关[10-12]。但关于KIF4A是否影响胃癌细胞的侵袭过程尚无报道。为了研究KIF4A对胃癌细胞侵袭过程的影响，笔者以SGC-shNC、SGC-shKIF4A1、SGC-shKIF4A2及SGC-shKIF4A3细胞株为实验模型进行细胞侵袭实验研究，并对下室层面的细胞进行计数。结果显示，在10倍镜下观察，SGC-shKIF4A1、SGC-shKIF4A2和SGC-shKIF4A3细胞株的侵袭细胞数约是SGC-shNC的7～10倍，差异均有统计学意义（P＜0.01）。表明SGC-shKIF4A细胞株内KIF4A的表达被抑制后，胃癌细胞侵袭能力增强。（图2）

图1Western Blot比较SGC-shNC和SGC-shKIF4A细胞中KIF4A蛋白的表达水平

2．3SGC-shKIF4A细胞中cortactin蛋白分子数量增加

侵袭性伪足（invadopodia）是细胞侵袭的重要结构，它可通过调控细胞外基质的降解促进细胞的侵袭。Cortactin蛋白分子对于侵袭伪足的形成及功能是必不可少的，是侵袭性伪足结构的重要组成部分，同时也是常用的侵袭性伪足的标记蛋白[14]。为了研究KIF4A是否通过影响侵袭伪足的形成进而影响细胞的侵袭能力，笔者对不同细胞株中的cortactin蛋白分子进行免疫荧光染色。鉴于细胞侵袭实验结果表明SGC-shKIF4A的3种细胞株侵袭能力间差异无统计学意义，故选择其中的一种细胞株进行实验。笔者采用免疫荧光染色法对SGC-7901、SGC-shNC及SGC-shKIF4A1细胞株中的cortactin蛋白分子进行染色，并在荧光显微镜下观察计数侵袭性伪足的数量（图3A，黄色箭头代表cortactin蛋白分子），并通过SPSS17.0软件进行数据分析（图3B）。结果显示，SGC-7901、SGC-shNC和SGC-shKIF4A1细胞株中cortactin蛋白分子数量分别为30.08±0.85、32.67±0.86、50.33±1.07；与SGC-7901和SGC-shNC细胞株比较，SGC-shKIF4A1细胞株中的cortactin蛋白分子数量明显增加（P＜0.01），即侵袭性伪足的数量增多（图3B），说明细胞的侵袭能力增强。

3 讨论与结论

驱动蛋白分子KIF4A是一种多功能马达蛋白分子，参与调控细胞有丝分裂、胞内大分子的转运以及神经元发育再生等多个细胞基本生命过程。笔者所在实验室最早报道KIF4A与胃癌的发生发展密切相关[15]。通过对胃癌以及对应的淋巴结转移组织进行免疫荧光染色，发现在40例胃癌病例中，有26例患者淋巴结中KIF4A的表达低于原发灶癌组织。通过免疫组织化学染色法分析KIF4A在23例胃癌患者组织标本中的表达情况，结果显示KIF4A在癌组织中与相应的癌旁组织相比低表达，并与胃癌的病理分化程度密切相关。进一步比较40例胃癌组织与其对应的转移淋巴结癌组织中KIF4A的表达情况，发现65%（26/40）的转移淋巴结癌组织中KIF4A的表达低于其对应的原发灶癌组织[11]。此外，KIF4A的低表达还与胃癌临床病理分期（TNM分期）密切相关[11]。这些研究结果表明，KIF4A在临床胃癌转移过程中发挥负调控作用，预示着驱动蛋白分子KIF4A可作为诊断治疗胃癌的新型生物分子靶点。

在本研究中，笔者应用实验室构建的驱动蛋白KIF4A稳定低表达的胃癌细胞，通过细胞侵袭实验，并经统计学分析，发现KIF4A稳定低表达细胞株的细胞侵袭能力明显强于对照组，说明KIF4A与细胞的侵袭能力负相关。免疫荧光染色结果表明，KIF4A稳定低表达细胞株中cortactin蛋白分子的数量增多。而cortactin蛋白分子对于侵袭性伪足的形成及功能是必须的，将cortactin蛋白招募到细胞膜上是侵袭斑形成的重要步骤[14]，因此KIF4A可能通过调节cortactin的功能及定位从而对侵袭性伪足的功能及形成有所影响，进而影响细胞侵袭能力，但其具体的分子机制尚不清楚，有待于进一步的研究。本研究率先发现了驱动蛋白KIF4A抑制胃癌细胞的侵袭作用，为KIF4A作为靶点应用于胃癌临床预后预测和有效治疗奠定理论基础。

利益冲突无

（图2、3见插页3-5）

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Chromokinesin KIF4A as a tumor suppressor by inhibiting cell invasion

Ji Meichao,Jiang Hongyu,Dong Zhixiong,Zhu Changjun
College of Life Sciences,Tianjin Normal University;Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance;Key Laboratory of Molecular and Cellular System Biology,Tianjin Normal University,Tianjin 300387,China

Zhu Changjun,Email:837175800@qq.com

ObjectiveTo explore the role of chromokinesin KIF4A in gastric cancer cell invasion using gastric cancer cells SGC-7901 and chromokinesin KIF4A deficient gastric cancer cells(SGC-shKIF4A).Methods Expression levels of KIF4A in controlling gastric cancer cells(SGC-shNC)and SGC-shKIF4A cells were determined by Western Blot.Invasion of gastric cancer cells were assessed using Transwell invasion assay and the number of cells passing through the matrigel was counted.Changing numbers of cortactin in SGC-7901,SGC-shNC,and SGC-shKIF4A cells were analyzed by immunofluorescence staining.ResultsCompared to the SGC-shNC cells,invasion ability of SGC-shKIF4A cells was increased.Compared to other cells,the numbers of cortactin in SGC-shKIF4A cells was also increased suggesting invadopodia in these cells was increased(P＜0.01).ConclusionsChromokinesin KIF4A acts as a tumor suppressor by inhibiting gastric cancer cells invasion and the results provides strong evidences for KIF4A serving as one of potent targets for gastric cancer prognostics and treatment in clinic.

KIF4A;Cortactin;Cell invasion;Gastric cancer cell

朱长军，Email：837175800@qq.com

10．3760/cma．j．issn．1673-4181．2016．03．003

国家自然科学基金面上项目（31271485）；2011年教育部“新世纪优秀人才支持计划”（NCET-11-1066）；国家自然科学基金青年基金项目（31301138）；天津市科技型中小企业技术创新资金资助项目（14ZXCXSY00121）

2016-02-15）