延边黄牛胚胎移植技术研究

金贞爱,姚雪瑞,高青山,许永男,李英花

（1.珲春市动物卫生监督所,吉林延边133000；2.延边大学农学院,吉林延边133000）

延边黄牛胚胎移植技术研究

金贞爱1,姚雪瑞2,高青山2,许永男2,李英花2

（1.珲春市动物卫生监督所,吉林延边133000；2.延边大学农学院,吉林延边133000）

试验以延边黄牛作为受体母牛,通过胚胎移植技术改善肉牛繁殖效率,增加母牛产仔率.延边黄牛体外生产胚胎移植时分为同期发情组1、同期发情组2和自然发情组,同期发情组1的受胎率最高,为29.63%,自然发情组的受胎率最低,为21.43%.首次获得了地方特色品种延边黄牛的体外受精胚胎移植牛.

延边黄牛；同期发情；胚胎移植

2013年我国肉牛业继续推进战略转型,散养户加速退出,规模化养殖比重逐步扩大,商品牛源持续紧张,导致肉牛价格不断飙升,因此,提高肉牛基础数量是目前尚待解决的首要问题.2014年我国规模化母牛养殖比重的扩大将成为肉牛业转型发展的主要表现形式,保证母牛存栏头数、缩短产犊间隔和提高繁殖效率是一个行之有效的解决办法[1].胚胎移植作为一门新兴技术能够有效减少疾病传播机率,是提高母牛产仔效率的重要手段之一.目前,胚胎移植技术主要在奶牛业应用广泛,但还未推广到肉牛业.因此,通过研究,可以试用饲养量较大的奶牛作为受体母牛,实施奶牛产肉牛的生产方试,不仅可以缓解肉牛来源等问题,还能够有效改善奶牛饲养的经济效益.

延边黄牛作为中国黄牛五大优良品种之一,在优质牛肉生产上占有一席之地,是不可或缺的优秀品种[2-3],但也同样面临着“牛源紧张”的问题.经过调查,延边黄牛存栏数由2007年的85万头左右,下降到2014年的55万头左右,下降了35%,可谓形式非常严峻,2015年国家出台良种可繁母牛补贴政策,但国内肉牛存栏增速缓慢；国家大力推进战略转型,散养户加速退出,但散养户及小规模养牛户仍是目前国内养殖业的主体.因此,通过先进技术手段改善肉牛繁殖效率,增加母牛产仔率等,是解决目前牛源问题的有效方法.同期发情技术、胚胎移植技术等生物技术的研究、改良及推广,能够加速规模化养殖进程,在地方特色品种的保护和扩繁上发挥关键作用.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

胚胎来源于动物胚胎工程实验室生产的延边黄牛体外受精胚胎.受体牛为本地延边黄牛,吉林瑞甸源生态农业有限公司50头,延边大学动物科学系教学牧场20头.

GnRh、PGF2a、CDIR、维生素ADE均购自韩国L&H生命工学研究所；移植枪、塑料硬外套、无菌软外套、细管、细管剪、阴道埋植器等均购自韩国.

1.2 试验方法

1.2.1 受体牛的选择考虑到胚胎不能长时间运输的原因,从牛来源处运输至本地饲养,实验室到教学牧场路程仅30 min.为了减少交通运输应激对试验结果的影响,提前2个月在吉林瑞甸源生态农业有限公司挑选3～5岁经产受体牛50头[4],首先通过血液检查排除有病的牛；再通过直肠检查淘汰有生殖疾病的牛,如子宫内膜炎,卵巢囊肿,子宫颈畸形等；另淘汰营养水平过高或过低的牛；最后考虑体型外貌适中的牛运回教学牧场,科学饲养管理,减少运输应激,做好移植准备.

1.2.2 同期发情处理同期发情组1：随机选择一天注射3 mL维生素ADE,过14 d注射GnRh 2 mL/头、同时将CIDR植入阴道记为第1天,第8天注射PGF2a2 mL/头并去除CIRD,第10天注射GnRh 2 mL/头, 12～16 h内观察发情情况并准确记录,第17天进行胚胎移植,移植时检查黄体发育情况[5],发育不完全的不移植.

同期发情组2：不肌注维生素ADE,第1天注射GnRh 2 mL/头、同时将CIDR植入阴道,第8天注射PGF2a 2 mL/头,第10天去除CIRD并注射GnRh 2 mL/头,12～16 h内观察发情情况并准确记录,第17天进行胚胎移植,移植时检查黄体发育情况[4],发育不完全的不移植.

1.2.3 胚胎移植在体视显微镜下观察受精卵的形态、色调、分裂球的大小、均匀度、细胞的密度、与透明带的间隙以及变性情况等.选择内细胞团和滋养层界线清晰、胚泡腔明显、细胞充满透明带内腔、形态完整、轮廓清晰、呈球形、分裂球大小均匀、结构紧凑、色调和透明带适中、无附着的细胞和液泡的胚胎装胚.

胚胎移植时可用0.25 mL细管分3段吸入IVCⅡ培养液,中间由两个气泡隔开,中段含有两枚胚胎.装胚后要在体视显微镜下检查确认胚胎是否在细管里.

移植时先用体积分数为70%的酒精棉球消毒装有胚胎的塑料吸管,然后剪掉封口一端,装入移植枪内,套上保护外套.采用直肠把握法进行移植,先将受体牛在保定架上保定好,在尾椎注射体积分数2%的盐酸利多卡10 mL,等尾部变软无力后开始移植,麻醉不完全子宫颈发硬、操作时不灵活且延长移植时间对胚胎生存不利.因移植枪外有无菌软外套移植前不必严格消毒受体牛外阴,只做一般清洗即可,然后直肠检查受体牛黄体发育情况,受体牛黄体要光滑、有弹性且质地充实,直径在10 mm以上,黄体状态不好不移植.移植时用左手扒开外阴,右手持移植器插入阴道,然后左手伸进直肠握住子宫颈,移植器到达子宫颈口时,助手将软外套扯破,左手从下方握住子宫颈也就是手背向下子宫颈在手掌上方,慢慢将子宫颈套入移植枪,也就是右手不用任何力量,只掌握方向,左手在直肠内诱导使枪头稳稳地送入黄体发育侧子宫角至大弯处缓缓推入胚胎,而非传统的用右手将移植枪插入子宫颈.本研究的方法熟练掌握后移植时间大大减少,而且对受体牛的生殖系统损伤非常小.出枪时也要注意不要损伤子宫内膜,出枪后马上消毒待用（见图1）.

图1 体外受精胚胎移植操作过程Tab.1 Effects of different treatments on transfer rate and pregnancy rate in Yanbian yellow cattle

2 结果与分析

不同处理组对延边黄牛受胎率和产犊率的影响结果见表1.

表1 不同处理组对延边黄牛受胎率和产犊率的影响Tab.1 Effects of different treatments on transfer rate and pregnancy rate in Yanbian yellow cattle

由表1可知,同期发情组1（添加维生素ADE）、同期发情组2和自然法各组之间无显著差异（P＜0.05）,其中受胎率最高组为同期发情组1,共同期发情43头,胚胎移植27头,妊娠8头,产犊7头,其受胎率和产犊率分别是29.63%和16.28%；受胎率最低组为自然发情组,共胚胎移植19头,妊娠4头,产犊2头（双胎）见图2,其受胎率和产犊率分别是21.43%和10.53%；同期发情组2共同期发情49头,胚胎移植38头,妊娠10头,产犊8头,其受胎率和产犊率分别是26.28%和21.05%.

图2 延边黄牛体外受精胚胎移植产双胎牛Fig.2 The twins cattle by in vitro fertilization and embryo transfer

3 讨论与结论

受体牛的综合体况是实施胚胎移植工作的首要条件[6],在选择受体母牛时,应按程序要求严格进行直肠检查,以确保受体牛空怀,没有卵巢、子宫等功能性疾病[7].这里要注意的是交通运输应激可能对受体牛有持续较长时间的影响,建议受体牛在移植前3个月不要长距离移动.

自然发情与同期发情比较,自然发情比同期发情经济成本底,但发情率远不如同期发情的发情率,这在放牧饲养中采用自然交配时比较合理,但如果采用人工受精和胚胎移植就会有发情鉴定出现误差[8],在人工受精或胚胎移植时容易错过最佳时机的可能,且自然交配易出现交叉感染现象.今后肉牛产业的走向是母牛向规模化、工厂化发展,此时采用同期发情虽然成本上有一定增长,但从提高母牛繁殖力角度出发是节省经济成本的；而且通过同期发情还可以调节劳动强度和节省劳动力,如可以在有着上千头母牛的大规模繁殖场有计划的安排发情,这样也可以避开恶劣的环境产仔,如北方的冬季,提高犊牛成活率,间接降低生产成本.

维生素ADE能有效改善受体牛的营养状况从而提高胚胎移植受胎率,但本研究试验结果与其它两组没有显著性差异,可能与肌注的量和时间有关,本研究选择肌注时间为同期发情开始之前.与韦英明等2000年的研究结果相同,可能是试验牛数量过少,不能在统计上显示差异,需要进一步研究[9].发情鉴定是否准确是提高胚胎移植受胎率的关键基础,体外胚胎生产就是高度模拟体内发育的环境.只有准确的发情鉴定才能使胚胎从体外移植到体内后对接其发育的连续性,鉴定的发情时间误差过大就会导致胚胎与体内环境不能同期化,影响胚胎正常桌床发育成胎儿.本研究胚胎移植采用2枚胚胎,结果出现了一对双胎,其中一头牛1周后死亡.诱发双胎和死亡一头可能属偶发现象,没有统计学意义,但值得进一步研究的是双胎中死亡一头,是否是双胎牛在胎儿期因营养竞争不利于存活.

研究妊娠检查是在胚胎移植30 d后经B超检查一次,120 d直肠检查一次,4月龄、5月龄、6月龄各流产一头.分析流产原因,可去除营养不良因素,因受体牛全期饲喂妊娠期全价饲料,胚胎质量问题导致流产的可能性最高,值得注意的是后期流产3头牛均为公犊,有待进一步深入研究.

延边黄牛体外生产胚胎移植时同期发情组1、同期发情组2、自然发情组三组数据没有显著性差异,三者的最高值为同期发情组1,三者最低组为自然发情组.首次获得了地方特色品种延边黄牛的体外受精胚胎移植牛.

[1]赵航,程玛丽,刘强德,等.2013年中国肉牛产业形势分析及2014年发展预测[C].第九届中国牛业发展大会论文集,2014.

[2]姜成国,毛元廷,李香子,等.延边黄牛公牛与阉牛产肉性能的比较[J].延边大学农学学报,2011,33（3）：157-162.

[3]王士勇,李钟淑,金庆国,等.共培养对延边黄牛重组胚体外发育的影响[J].延边大学农学学报,2008,30（3）：192-196.

[4]李玉轩,刘秋霞.青年牛不适宜做胚胎移植[J].中国奶牛,2005（2）：38-39.

[5]李晓锋,陈明新,蔡铭运,等.三峡库区奶牛胚胎移植试验初报[J].湖北畜牧兽医,2004（4）：16-17.

[6]梁坤,王洪宝,韩永胜,等.牛胚胎移植受体的选择方法[J].黑龙江动物繁殖,2002（2）：15-17.

[7]贺奋义,桑国俊,邱忠玉.牛胚胎移植技术研究与应用[J].中国牛业科学,2009（3）：25-26.

[8]尹世东,米占锋,孔伟,等.母牛自然发情与同期发情受胎率的对比分析[J].甘肃畜牧兽医,2013（7）：38-39.

[9]韦英明,卢晟盛,蒋如明,等.维生素ADE和孕马血清促性腺激素分别结合前列腺素对母黄牛同期发情和受胎效果的试验[J].中国畜牧杂志,2000（1）：31-32.

（责任编辑：卢奇）

Study on embryo transfer technology of Yanbian yellow cattle

JIN Zhenai1,YAO Xuerui2,GAO Qingshan2,XU Yongnan2,LI Yinghua2
（1.Hunchun City Animal Health Supervision,Yanbian 133000,China；2.Agricultural College of Yanbian University,Yanbian 133000,China）

Yanbian cattle with larger local feeding was used as the recipient cows to improve the breeding efficiency and increase the calving rate of the cow by embryo transfer.The in vitro produced Yanbian yellow cattle embryos were transfer to estrus synchronization group 1,estrus synchronization group 2 and natural estrus group of the recipient cattle.The pregnancy rate was highest value in the estrus synchronization group 1（29.63%）,and lowest in the natural estrus group（21.43%）.Yanbian yellow cattle was first produced by transfer of the in vitro fertilized embryos.

Yanbian yellow cattle；embryo transfer；estrus synchronization

S823.3

A

1008-7516（2016）06-0038-04

10.3969/j.issn.1008-7516.2016.06.010

2016-11-03

吉林省科技厅“双十工程”重大科技攻关项目（20140201004NY）

金贞爱（1967—）,女,朝鲜族,吉林蛟河人,畜牧兽医师.主要从事畜牧学研究.

李英花（1981—）,女,朝鲜族,吉林汪清人,博士,实验师.主要从事胚胎工程研究.