不同基质酵母浸膏对cAMP合成菌生长的影响

李俊惺,徐晓静,李会军,刘景良,陈延慧,常景玲

（1.现代生物育种河南省协同创新中心,河南新乡453003；2.河南科技学院,河南新乡453003；3.辉县市北云门镇人民政府,河南辉县453631）

不同基质酵母浸膏对cAMP合成菌生长的影响

李俊惺1,2,徐晓静1,2,李会军3,刘景良1,2,陈延慧1,2,常景玲1,2

（1.现代生物育种河南省协同创新中心,河南新乡453003；2.河南科技学院,河南新乡453003；3.辉县市北云门镇人民政府,河南辉县453631）

选取7种不同基质酵母浸膏配制种子培养基,设定8、10、12 g/L三个质量浓度,摇床培养cAMP合成菌,对菌落密度、种子液pH、菌体浓度（OD值）和葡萄糖比消耗率等参数进行综合分析,研究不同基质酵母浸膏种子培养基对cAMP合成菌生长的影响.结果表明：cAMP合成菌的种子培养基中酵母膏最佳质量浓度为8 g/L,以使用啤酒废酵母浸膏和蔗糖糖蜜酵母浸膏更为适宜.

酵母浸膏；cAMP合成菌；菌落密度；OD值；葡萄糖比消耗率

环磷酸腺苷（cAMP）是人体内广泛存在的一种具有重要生理活性的物质[1-3],作为细胞内的第二信使,对糖、脂肪的代谢,核酸、蛋白质的合成起着重要的调节作用.cAMP在医药及动物饲料添加剂领域用途广泛,发挥着重要作用[4-6].当前,利用微生物发酵生产cAMP是最高效、最节能的方法之一,发酵过程中菌种的活性和稳定性是决定发酵水平的关键因素.酵母浸膏是cAMP发酵种子培养基中的主要成分之一,为cAMP发酵种子生长提供重要营养.酵母抽提物是一种以酵母细胞作为原料,通过酵母细胞自溶破壁和酵母自身的酶系对酵母细胞质进行水解,或以酶制剂进行水解后再经一系列抽提浓缩等精制工序得到的产物,其主要成分为多种氨基酸、肽类物质、核苷酸、D族维生素等,是一类营养丰富的有机氮源[7].本试验主要研究了不同基质酵母浸膏对cAMP合成菌生长的影响,以确定cAMP合成菌种子培养基中最佳酵母浸膏的类型和用量.

1 材料与方法

1.1 试验材料

菌种：节杆菌（Arthrobacter sp.）A.sp01,河南科技学院生命科技学院发酵工程实验室保存菌株.

试剂：葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、NaCl、尿素、酵母浸膏、琼脂、NaCl、HCl,均为生化试剂.

酵母浸膏：A,大豆基质酵母浸膏；B,生化试剂酵母浸膏；C,甜菜基质酵母浸膏；D,纯大豆浸膏；E,啤酒废酵母浸膏；F,大豆蛋白胨；G,蔗糖糖蜜酵母浸膏.

仪器：LDZX-50KBS高压灭菌锅（上海申安医疗器械厂）,双人垂直净化工作台（苏净集团安泰公司制造）,DNP-9082-1A电热恒温培养箱（上海圣科仪器设备有限公司）,DHG-9140A电热鼓风干燥箱（上海三发实验仪器厂）,ZWF-2112摇床（上海智城分析仪器制造有限公司）,UV-5800紫外分光光度计（上海元析科技仪器有限公司）,SGD-Ⅳ全自动还原糖测定仪（山东省科学院）.

培养基：斜面培养基：葡萄糖1 g,蛋白胨1 g,牛肉膏1 g,NaCl 0.3 g,尿素0.4 g,酵母膏1 g,琼脂2 g,加蒸馏水至100 mL,调pH值至7.0,121℃、高压蒸汽灭菌30 min.

种子培养基：葡萄糖1 g,蛋白胨1 g,牛肉膏1 g,NaCl 0.3 g,尿素0.4 g,酵母浸膏设置0.8、1.0、1.2 g三种处理,加蒸馏水至100 mL,调pH值至7.2,121℃、高压蒸汽灭菌30 min.

1.2 试验方法

1.2.1 菌种活化将保藏菌种接种于斜面培养基上,在30℃恒温培养箱中培养24 h,观察其生长情况.可活化2次,备用.

1.2.2 种子培养挑取斜面菌种接种于装有30 mL种子培养基的250 mL锥形瓶中,于摇床上30℃、110 r/min培养24 h.

1.2.3 菌种生长活性检测采用平板菌落观察、分光光度法测定540 nm波长处种子培养液OD值增长、种子培养液pH和残糖变化判定菌种的生长活性[8].

2 结果与分析

2.1 不同基质酵母浸膏培养基种子生长菌落密度

cAMP发酵种子摇床培养24 h涂平板,不同基质酵母浸膏培养基种子生长菌落特征表现基本一致,菌落凸起,半透明,呈乳白色,没有气味,易于挑起,但平板中菌落密度差异较大,结果见表1.

表1 不同基质酵母浸膏种子培养平板菌落密度Tab.1 Comparison of different substrate yeast extract seed culture plate colony density

由表1可知,随着cAMP发酵种子培养基中不同基质酵母浸膏质量浓度的增加,菌落密度逐渐降低.种子培养基中酵母浸膏质量浓度在8.0 g/L时,菌落密度都较大.7种酵母浸膏中以啤酒废酵母浸膏（E）和蔗糖糖蜜酵母浸膏（G）培养的菌落密度最大,表明种子培养基中使用啤酒废酵母浸膏和蔗糖糖蜜酵母浸膏时菌种活性更强.

2.2 不同基质酵母浸膏液体培养菌体的OD值

cAMP发酵种子摇床培养24 h后,使用紫外分光光度法测定波长540 nm处的菌体OD值,结果见表2.酵母浸膏种类、质量浓度对种子生长影响的显著性分析结果见表3.

表2 不同基质酵母浸膏种子培养菌体的OD值Tab.2 OD value of different substrate yeast extract seed culture concentration

表3 酵母浸膏对菌体OD值影响的方差分析结果Tab.3 The variance analysis results of cell OD value by different substrate yeast extract seed culture

由表2、表3可知,随着cAMP发酵种子培养基中不同基质酵母浸膏质量浓度的增加,菌体的OD值基本呈降低趋势.种子培养基中酵母浸膏质量浓度在8.0 g/L时,菌体的OD值都较大.7种酵母浸膏中以啤酒废酵母浸膏（E）和蔗糖糖蜜酵母浸膏（G）培养的菌体OD值最大,表明种子培养基中使用啤酒废酵母浸膏和蔗糖糖蜜酵母浸膏时菌种的活性更强.方差分析结果显示,酵母浸膏的种类和质量浓度对菌体OD值的影响均为极显著.

2.3 不同基质酵母浸膏种子培养液的pH

cAMP发酵种子摇床培养24 h后,种子液的pH变化见表4.

表4 种子液pH的变化Tab.4 pH changes of seed liquid

由表4可知,不同处理条件下cAMP发酵种子培养液的pH值均在8.5左右,表明同一菌种在不同基质酵母浸膏质量浓度种子培养基中的生长代谢基本稳定.

2.4 不同基质酵母浸膏种子培养液中的残糖含量

cAMP发酵种子摇床培养24 h后,种子液中残糖的质量分数见表5.

表5 种子液中残糖的质量分数Tab.5 The mass fraction of residual sugar in seed liquid%

由表5可知,cAMP发酵种子培养基中不同基质酵母浸膏质量浓度为8.0 g/L时,种子培养液残糖的质量分数为0.20%～0.27%；不同基质酵母浸膏质量浓度为10.0 g/L时,种子培养液残糖的质量分数为0.22%～0.32%；不同基质酵母浸膏浓度12.0 g/L时,种子培养液残糖的质量分数为0.27%～0.29%.种子培养基中酵母浸膏质量浓度在8.0 g/L时,种子培养液残糖的质量分数都较低,其中以啤酒废酵母浸膏（E）和蔗糖糖蜜酵母浸膏（G）的种子培养液残糖质量分数为最低.

菌种培养过程中的耗糖量,不能直观判断菌种的活力大小,需计算葡糖糖消耗比速率来判断,不同基质酵母浸膏种子培养葡萄糖消耗比速率见表6.酵母浸膏种类、质量浓度对种子生长的影响的方差分析结果见表7.

表6 不同基质酵母浸膏种子培养的葡萄糖消耗比速率Tab.6 Rate of the glucose consumption in seed culture

表7 酵母浸膏种子培养的葡萄糖消耗比速率方差分析结果Tab.7 The variance analysis of rate of glucose consumption in seed culture

由表6可知,种子培养基中酵母浸膏质量浓度为8.0 g/L时,不同基质酵母浸膏种子培养的葡萄糖消耗比速率均较高,其中以啤酒废酵母浸膏（E）和蔗糖糖蜜酵母浸膏（G）的种子培养葡萄糖消耗比速率为最高.表明种子培养基中使用啤酒废酵母浸膏（E）和蔗糖糖蜜酵母浸膏（G）时菌种菌体量最大,活性最强.方差分析结果显示,酵母浸膏的种类和质量浓度对葡糖糖消耗比速率的影响均为极显著,对菌体浓度的影响也为极显著.

3 小结

通过对不同基质酵母浸膏在种子培养基中的应用可知,酵母浸膏的种类和质量浓度都对cAMP产生菌的生长有极其显著的影响.对菌落密度、种子液的pH、菌体浓度（OD值）和糖代谢（糖度）等参数的综合分析结果表明,cAMP产生菌的种子培养基中酵母浸膏质量浓度以8.0 g/L为最佳,供试的酵母浸膏中,啤酒废酵母浸膏和蔗糖糖蜜酵母浸膏最适宜.

[1]ANTONI F A.Molecular diversity of cyclic AMP signalling[J].Frontiers in Neuroendocrinology,2000,21（2）：103-132.

[2]MAGHAZACHI A.Choleratoxin inhibits interleukin-2-induced,but enhances pertussis toxin-induced T-cell proliferation：regulation by cyclic nucleotides[J].Immunology,1992,75（1）：103-107.

[3]徐晓静,余筱敏,李俊惺,等.添加次黄嘌呤对环磷酸腺苷发酵产苷的影响[J].河南科技学院学报（自然科学版）,2016, 44（3）：22-25.

[4]SHANKAR R,ZHU J S,BARON A.Glucosamine infusion in rats mimics the β-cell dysfunction of non-insulin-dependent diabetes mellitus[J].Metabolism,1998,47（5）：573-577.

[5]MCPHEE I,GIBSON L C,KEWNEY J,et al.Cyclic nucleotide signalling：a molecular approach to drug discovery for Alzheimer’s disease[J].Biochemical Society Transactions,2005,33（6）：1330-1332.

[6]MOUTINHO A,HUSSEY P J,TREWAVAS A J,et al.cAMP acts as a second messenger in pollen tube growth and reorientation[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2001,98（18）：10481-10486.

[7]胡成远,陈雄,唐冠群,等.几种不同来源酵母抽提物对两株乳杆菌生长的比较研究[J].中国酿造,2009（7）：50-53.

[8]伍国明.酵母浸膏蛋白胨与pH对草菇培养与生物学效率影响[J].中国食用菌,2009,28（1）：27-29.

（责任编辑：邓天福）

Effect of yeast extract with different substrates on the growth of cAMP synthesis Bacteria

LI Junxing1,2,XU Xiaojing1,2,LI Huijun3,LIU Jingliang1,2,CHEN Yanhui1,2,CHANG Jingling1,2
（1.Cllabortive Innovation Center of Modern Biological Breeding,Xinxiang 453003,China；2.Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China；3.The People’s Government of Beiyunmen Town,Huixian 453631,China）

The effects of yeast extract medium with different substrates on the growth of cAMP synthesis bacteria was investigated and yeast extract with 7 different substrates were selected for seed medium preparation with concentrations of 8,10,12 g/L,respectively.The results showed that yeast extract concentration of 8 g/L was the optimal content and the combination of waste beer yeast extract and sugar molasses yeast extract was most appropriate for cAMP synthesis bacteria growing via comprehensive analysis of various parameters including colonies density,pH,cell concentration（OD）and glucose consumption rate and so on.

yeast extract；cAMP synthesis bacteria；colony density；OD value；glucose consumption rate

S858.31

A

1008-7516（2016）06-0009-04

10.3969/j.issn.1008-7516.2016.06.003

2016-03-15

国家级大学生创新创业训练计划项目（201410467001）

李俊惺（1993―）,女,河南平顶山人,本科生.

常景玲（1963―）,女,河南新乡人,教授.主要从事发酵制药研究.