体外受精-胚胎移植周期中单原核(1PN)胚胎的研究进展

张亚楠，殷宝莉，张翠莲，姜李乐，韦多，谢娟珂

(郑州大学人民医院/河南省人民医院生殖医学研究所，郑州　450003)

体外受精-胚胎移植周期中单原核(1PN)胚胎的研究进展

张亚楠，殷宝莉，张翠莲*，姜李乐，韦多，谢娟珂

(郑州大学人民医院/河南省人民医院生殖医学研究所，郑州450003)

【摘要】在体外受精-胚胎移植(IVF-ET)中，常常有单原核(1PN)胚胎出现。这类胚胎最终发展为非整倍体的比例偏高，胚胎发育潜能及妊娠结局极差。本文对近年来国内外有关1PN胚胎的研究进行总结，认为1PN胚胎的形成可能有多种机制，但尚无明确定论。因1PN胚胎的染色体组成多异常，多数研究不建议移植1PN胚胎；然而，国内外也有不少研究已证实，1PN胚胎中染色体正常者也占有一定比例，尤其是IVF-1PN胚胎，可能是正常受精的胚胎，移植IVF-1PN胚胎可获得健康的子代个体。因此，在临床工作中，对于那些无可利用胚胎的患者，在充分告知患者知情同意后，选择IVF-1PN胚胎进行移植不失为一个选择。

【关键词】1PN胚胎；体外受精；卵胞浆内单精子注射；染色体；非整倍体

(J Reprod Med 2016，25(5)：473-477)

体外受精-胚胎移植(IVF-ET)过程中，常规于授精后16～18 h对胚胎的受精情况进行观察[1]。目前，国内外专家普遍认同的正常受精的判断标准为：授精后16～18 h观察到胚胎内存在明确的双原核(2PN)及双极体(2PB)[2]。然而，在实际的胚胎培养过程中，常有较多的异常受精出现，其中单原核(1PN)的发生率约为2%～5%[3]，因1PN胚胎的非整倍体比例较高而常视为异常受精胚胎，与多原核胚胎及发育停滞的2PN胚胎一起作为废弃胚胎被销毁。事实上，部分1PN胚胎为正常受精的二倍体胚胎，若将这类胚胎全部废弃，在一定程度上会造成胚胎资源的浪费。

2012年《河南医学研究》杂志发表了一篇关于IVF-ET周期中1PN及0PN胚胎的非整倍体性的综述，主要阐述了1PN胚胎及0PN(2PB)胚胎的形成机制和染色体组成[3]。近期，关于1PN胚胎的研究又有了一些新的进展，故本文对近些年国内外关于1PN胚胎的研究发现进行总结，主要就其形成机制及染色体组成、是否可供移植及应用等方面予以综述，为临床决策提供证据支持。

一、1PN胚胎的形成机制

受精后的卵母细胞于正常情况下出现2个原核，即雄原核和雌原核。而在实际工作中，原核评分时常观察到仅有1个原核的胚胎，即1PN胚胎。关于1PN胚胎发生的具体机制尚不明确，目前国内外学者普遍认为1PN胚胎的形成主要包括以下机制。

1. 孤雌激活(parthenogenetic activation)：与常规IVF比较，ICSI-1PN胚胎更可能是由于孤雌激活所致，而非正常受精[4]。

2. 精子染色体解聚异常：精子染色体解聚异常时，进入卵母细胞中的精子可激活，但雄原核的形成受阻。若在ICSI操作过程中对精子膜进行部分破坏，可以确保精子染色质的正常解聚，降低1PN胚胎的形成[5]。

3. 雌雄原核形成不同步(asynchronously)：正常情况下，雌雄原核的形成是同步发生的。若雌雄原核形成不同步，则一般于原核观察10～120 min后可观察到第二个原核[6]。

4. 雌雄原核融合：精卵在体外结合后，如果受精提前，或是雌雄原核在原核膜形成前就已融合，将在进行原核评分时就只能观察到一个原核，这类胚胎为正常受精胚胎[7]。

5. 雌原核形成异常：导致雌原核形成异常的原因可能是ICSI注射过程破坏了减数分裂的纺锤体，抑制了雌原核的形成，也可能是某些内外因素导致第二极体滞留所致[8]。除此之外，卵母细胞激活障碍，纺锤体及星状体缺陷也是雌原核形成障碍的重要因素[9]。

6. 成熟前原核核膜破裂(premature pronuclear envelope breakdown，pPNBD)和原核分裂(karyokinesis)：在IVF-ET过程中，常于授精后的23～46 h发生原核核膜的破裂，父源染色体与母源染色体立即发生融合，原核核膜破裂的机制尚不清楚[10]。若原核核膜提前破裂，在观察原核时可能看到胚胎只有一个原核，Azevedo等[11]采用荧光原位杂交技术(FISH)联合免疫细胞化学检测的方法，证实了原核核膜的提前破裂可能是导致部分1PN胚胎形成的原因。此外，该研究还发现了部分1PN胚胎有两个单倍体的雌原核和一个单倍体的雄原核，并且雄原核和其中一个雌原核发生了pPNBD，出现两个雌原核的原因可能是雌原核分裂形成。上述机制仍需进一步的研究证实。

1PN胚胎的形成除上述机制外，还受到其他因素的影响。通过比较1PN周期和非1PN周期发现，1PN胚胎的形成与患者的一般情况、卵巢刺激方案、胚胎学特征及临床结局无关[12-16]，而与排卵延迟、卵母细胞过熟及培养液中的Ca2+浓度有关[17]。此外，精子的来源也可能会对1PN胚胎的产生造成一定影响。Anderson等[18]研究发现，在ICSI周期中，射精组1PN的发生率为2.9%，手术取精组的发生率为6.1%，这可能是因为手术取出的精子没有经历正常的成熟过程，未成熟精子不易解螺旋所致。Balakier等[19]则发现在1PN胚胎周期中，往往有较多的卵母细胞数及较高的临床妊娠率。

二、1PN胚胎是否具有临床价值

1. 1PN胚胎中的单倍体和二倍体：目前，国内外许多学者对1PN胚胎的染色体进行了研究，然而，各文献中1PN胚胎的单倍体和二倍体的发生率不一。Van等[20]对IVF/ICSI-1PN胚胎进行FISH后发现，IVF-1PN胚胎的性染色体二倍体率为54.35%，单倍体率为23.91%，嵌合体率为21.74%，而在ICSI-1PN胚胎则分别为34.62%、34.61%和30.77%，结果与先前的研究[12，14]相似，即无论采用细胞基因学技术还是FISH，IVF-1PN胚胎的二倍体均率明显高于ICSI-1PN胚胎，说明不同的授精方式在1PN胚胎的染色体组成上起着非常重要的作用，IVF-1PN胚胎较ICSI-1PN胚胎更可能为二倍体。Macas等[15]的研究甚至发现，ICSI-1PN胚胎并无二倍体。Staessen等[16]的研究结果则与此不同：对1PN胚胎进行FISH发现，无论是IVF-1PN胚胎，还是ICSI-1PN胚胎，均只有一小部分为二倍体。另有研究认为无论是采用细胞基因学检查联合FISH[19]，还是聚合酶链反应(PCR)联合FISH[13]，均发现IVF-1PN胚胎的二倍体率较低。

上述研究的结果并不一致，导致这些差异的原因可能与采用的方法、胚胎发育天数、检测染色体数目，以及分类标准的不同有关。然而，在所有的研究中，无论IVF-1PN胚胎的二倍体率高或是低，IVF-1PN胚胎的二倍体率均高于ICSI-1PN胚胎，原因是ICSI-1PN胚胎更可能是非受精胚胎。ICSI操作过程中可能会破坏减数分裂的纺锤体，抑制雌原核的形成，从而形成1PN胚胎；更多的是ICSI显微注射时的机械刺激使得卵母细胞发生孤雌激活，即使染色体组成为二倍体，也不能认为其是正常受精的二倍体胚胎。同时，ICSI较常规IVF而言，培养液中的Ca2+浓度及精子的解螺旋能力发生了更多的改变，更易形成1PN胚胎。根据1PN胚胎的形成机制及IVF/ICSI的操作特点，可以认为，IVF-1PN胚胎染色体正常的几率更大。

2. 1PN胚胎能否移植：在临床工作中，经常会有一些患者因无可利用胚胎形成而取消周期，这给患者精神上带来很大的痛苦和压力。而在这些患者中，常有第2天(D2)/D3发育为形态学上均一、无碎片或碎片少的4/8-细胞的1PN胚胎。对于这类胚胎能否进行移植研究者各抒己见。

有学者认为，这类胚胎常存在染色体非整倍体异常，总体胚胎质量较差，发育潜能较低，出现胚胎停育的几率较大，故不具有移植价值。即使对其进行移植，也容易发生流产、死胎、发育停滞等状况。正常情况下，雌雄原核最迟出现在授精后20 h，雌雄原核同步形成的发生率约为63%～74%，若形成不同步，则雄原核先出现，10～120 min后可观察到雌原核。故Azevedo等[11]对授精后24 h的卵母细胞进行观察，以确保无雌雄原核形成不同步的现象，研究采用FISH分析IVF/ICSI周期中1PN胚胎的染色体组成，发现1PN胚胎的发生率约为2.7%～17%，同时1PN胚胎的二倍体率也较低，故不建议移植1PN胚胎。国内外其他一些学者也得到了类似的结论[21-22]。Reichman等[23]对IVF/ICSI-1PN胚胎研究发现，与2PN胚胎相比，1PN胚胎发育至第3天时，卵裂球数目较少，发育速度缓慢，且碎片比例较高，细胞对称性差，对98个1PN胚胎进行移植后，种植率为6.4%，最终活产1女婴，活产率为1.3%。与2PN胚胎的种植率和妊娠率比较后发现，1PN胚胎的利用价值非常低。因此，虽然对部分患者移植1PN胚胎后有健康子代出生，但由于其种植率、临床妊娠率及活产率极低，故临床上仍不建议移植1PN胚胎。

事实上，1PN胚胎在一定程度上可能是正常受精的胚胎，可能是错过了最佳的观察时机，或者是因为雌雄原核形成不同步或雌雄原核融合等原因，导致在进行原核评分时只观察到一个原核。通过以上的讨论，可以得出，IVF-1PN胚胎较ICSI-1PN胚胎染色体正常的几率更大，即使是二倍体的ICSI-1PN胚胎，也可能为孤雌激活而非正常受精。因此，如果这类胚胎能够移植，建议移植IVF-1PN胚胎，而不能移植ICSI-1PN胚胎。国内外有不少学者持相同观点，认为可人为地通过各种检测手段筛选出染色体正常的IVF-1PN胚胎进行移植，以增加困难患者临床妊娠的概率。目前已有不少1PN胚胎活产的案例报道，且随访结果显示，与2PN胚胎相比，移植IVF-1PN胚胎活产的子代并无异常[23-26]。

已有研究证实，IVF-1PN胚胎可能为正常受精的二倍体胚胎。然而，其染色体组成的正常与否无法简单地依靠形态学特征进行区分，所以应寻找有效的筛选正常染色体的方法来改善IVF的临床结局。通过囊胚培养可筛选出具有高发育潜能的染色体正常的1PN胚胎[24]，提高卵母细胞的利用率，改善困难患者的周期结局，但1PN胚胎的囊胚形成率往往较低[27]。Liao等[28]对1PN胚胎进行了系统的细胞基因学检测后发现，囊胚组1PN胚胎的二倍体率明显高于卵裂期胚胎组，说明囊胚的形成过程可排除部分染色体异常的胚胎，Sandalinas等[29]的研究结果与其一致，故囊胚的形成可作为正常受精和染色体正常的一个重要的形态学指标。通过囊胚培养可在一定程度上有效地筛选出染色体正常的胚胎。然而，研究同时也发现了1PN囊胚的嵌合体及非整倍体发生率与1PN卵裂期胚胎的相似[28]，说明囊胚培养并不能排除这两类异常胚胎。故临床上可通过对1PN胚胎行囊胚培养来筛选正常胚胎进行移植，但必须严格地进行产前检查，以便及早发现异常胎儿。

3. 1PN胚胎在其他方面的应用：随着干细胞研究的快速进展，干细胞的来源也越来越广。目前，有学者采用孤雌激活的1PN胚胎来建立新的胚胎干细胞系，并取得了一定成果。Lin等[30]于2007年报道了第1例应用IVF/ICSI周期中孤雌激活来源的1PN胚胎建立人类胚胎干细胞系，其表达的分子标记和基因与正常胚胎干细胞相同，经过50余代的传代培养后，细胞仍未发生分化，保持一个稳定的染色体核型：46，XX。采用全基因组单核苷酸多态性分析和DNA指纹识别技术进一步证实了该细胞系具有纯合性。所以，在IVF/ICSI治疗过程中被丢弃的孤雌激活来源的1PN胚胎，可作为纯合的人类胚胎干细胞的来源，为获得纯合的人类胚胎干细胞提供了一种新方法。此后，相继有研究[31-32]得到类似的结果。

三、展望

1PN胚胎染色体异常的可能性较大，即使是含有Y染色体的1PN胚胎，也只能说明卵母细胞受精，不能排除1PN胚胎是非整倍体的可能。非整倍体的1PN胚胎基本不具备种植潜能，即便是成功着床，也会在孕早期发生自然流产，很少有非整倍体的胚胎活产，故临床工作中常规将此类胚胎丢弃。

近些年来兴起的time-lapse技术可以在封闭环境下动态地观察胚胎发育情况，鉴别出那些因错过了最佳的观察时机、雌雄原核不同步及雌雄原核融合等导致的1PN胚胎，但因其价格昂贵且不能有效地改善妊娠结局、提高辅助生殖技术的安全性[33]，尚未在各个生殖中心广泛采用。囊胚培养可筛选出部分染色体组成相对正常的1PN胚胎。鉴于囊胚培养目前已可以作为一项常规技术在许多生殖医学中心开展，临床上可通过对1PN胚胎行囊胚培养来淘汰部分异常胚胎，选择优质囊胚作为移植的备选选项，但必须充分告知患者可能的风险，并严格地进行随访，要求患者常规进行产前检查，以及早发现异常胎儿。

胚胎植入前遗传学筛查(PGS)技术是以提高妊娠率、活产率为目的的早期产前诊断方法，作为选择胚胎的一种方式，在临床上已得到了越来越广泛的应用[34]。随着技术的不断革新与进步，新的更为全面、准确的基因筛查技术也层出不穷，CCS(Comprehensive Chromosome Screening)技术又名比较基因组杂交-胚胎植入前基因筛查技术，是一种基于DNA的基因筛查技术，可以筛查全部的染色体或是部分非整数倍染色体，在不损害胚胎的情况下就能检测出全部的基因遗传学问题，确保植入子宫内的胚胎是完全正常的[35]。胚胎种植前基因诊断(PGD)/PGS/CCS测序技术日益成熟，若将其用于无可利用胚胎的患者，对1PN胚胎进行筛查，挑选正常可移植的1PN胚胎，将改善这类患者的妊娠结局。

综上所述，对于临床助孕治疗中无可利用胚胎或可利用胚胎数目不足的患者，移植IVF-1PN胚胎不失为一个选择。因1PN胚胎的形成机制尚不明确，尚需要大量的实验和研究，从根本原因出发，避免1PN胚胎的产生，提高患者卵母细胞利用率。进一步结合time-lapse观察结果、囊胚培养及PGD/PGS/CCS等新型的筛选优质胚胎的方法来选择正常胚胎进行移植，并随访患者的妊娠结局。

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[编辑：谷炤]

Research advance in embryos derived from monopronucleated zygotes in IVF/ICSI cycles

ZHANG Ya-nan，YIN Bao-li，ZHANG Cui-lian*，JIANG Li-le，WEI Duo，XIE Juan-ke

Medical Reproduction Center，People’s Hospital of Zhengzhou University/Henan Provincial People's Hospital,Zhengzhou450003

【Abstract】In the procedure of human assisted reproduction，embryos derived from monopronucleated zygotes which assume a definite proportion of the numerous morphological normalities. These oocytes could develop into aneuploidy to a scale and affect the embryonic development and pregnancy outcomes consecutively. Whether the embryos derived from monopronucleated zygotes could be transfered in the process of assisted reproduction has not been determined. The review is focused on the discoveries about the single pronucleated zygotes overall the world during the past decades and found that a group of factors have an association with its formation mechanism. The majority of the studies suggested that embryos developed from 1PN zygotes should be discarded for any reproductive purpose as their chromosome constitution are more likely abnormal. Both domestic and foreign researchers，however，have confirmed that the monopronucleated zygotes may fertilize normally，especially IVF-1PN，and develop into a healthy baby. According to this point of view，transplatation of single pronucleated embryos in IVF cycles may be a good option for the couples who obtained none good quality embryos，after they are given fully informed consent.

【Key words】Human monopronucleated zygotes；IVF；ICSI；Chromosome；Aneuploid

DOI：10.3969/j.issn.1004-3845.2016.05.018

【收稿日期】2015-09-03；【修回日期】2015-10-22

【基金项目】河南省科技厅重点科技攻关项目(No.1221023 10536);河南省医学科技攻关计划重点项目(No.201202022)

【作者简介】张亚楠，女，河南漯河人，硕士，生殖医学专业.(*通讯作者)