靶向调控大鼠海马CNN3基因表达载体的构建及鉴定

孙俊梅，龙晶晶，韩雁冰，蔡雪梅，陆　地，边立功，郭家智，李　梅

(昆明医科大学第一附属医院1. 神经内科；2.检验科， 昆明　650031；

3. 昆明医科大学生物医学工程研究中心，昆明　650500)



研究报告

靶向调控大鼠海马CNN3基因表达载体的构建及鉴定

孙俊梅1，龙晶晶1，韩雁冰1，蔡雪梅2，陆地3，边立功3，郭家智3，李梅1

(昆明医科大学第一附属医院1. 神经内科；2.检验科， 昆明650031；

3. 昆明医科大学生物医学工程研究中心，昆明650500)

【摘要】目的建立可调控大鼠局部脑区CNN3基因表达的技术，为进一步研究CNN3基因参与脑内病理生理过程奠定基础。方法设计并合成针对CNN3基因的全长编码序列cDNA和3条shRNA干扰靶点序列，利用基因工程技术构建CNN3-OE和3个CNN3-shRNA慢病毒载体，在立体定位仪引导下注入大鼠海马，采用蛋白免疫印迹技术筛选CNN3基因的最佳沉默序列，并找出重组表达和沉默慢病毒载体调控海马CNN3基因的变化规律。结果CNN3-OE和 3个CNN3-shRNA慢病毒干扰载体均构建成功，转染后8周内对海马CNN3基因水平均有一定调控作用，其中CNN3-shRNA2载体组在转染后的8周内海马CNN3基因编码蛋白calponin-3水平均显著性下调，最高抑制率为73.26%；CNN3-OE慢病毒载体组中海马calponin-3蛋白水平具有统计学意义的升高仅在转染后第14天，上调率为93.88%。结论通过定位注射CNN3-OE和 CNN3-shRNA慢病毒载体可在体调控局部脑区CNN3基因表达，为后续的机制研究和开拓疾病防治新途径奠定基础。

【关键词】CNN3；基因; 沉默；重组；慢病毒载体

1995年Maguchi等[1]首次分离出CNN3基因，其编码的calponin-3蛋白可与肌动蛋白、钙调蛋白、肌钙蛋白和原肌球蛋白结合，不仅分布在肝、肺、肾、肌肉、皮肤、卵巢[2-5]，还是calponin家族中唯一分布在中枢神经系统的一个亚型，在大脑、小脑和脑血管均有表达[6-8]，尤其是近年来研究显示CNN3基因及calponin-3蛋白异常可能改变大脑海马内神经元形态，甚至导致突触重塑[9，10]。本课题组前期研究也观察到CNN3基因和calponin-3蛋白在癫痫患者及大鼠大脑海马组织和脑脊液内表达水平显著升高，提示可能参与癫痫发生，但具体机制尚未阐明[11]。其中的一个重要原因就是目前尚未建立可靶向沉默或过表达活体动物局部脑区的CNN3基因可靠技术。倘若能定向定量在体调控实验动物脑内CNN3基因表达水平，将对阐明CNN3基因功能、深入研究其在突触重塑及癫痫等脑内病理生理过程中的确切作用及开辟新的治疗途径等具有重要意义。因此我们将构建针对大鼠CNN3基因的shRNA及过表达(OE)慢病毒载体，再通过活体定位局部注射靶向沉默或上调大鼠海马CNN3基因表达水平，并进行验证。

1材料和方法

1.1主要试剂

感受态细胞DH5α、pGMLV-sc5 RNAi慢病毒载体、293T细胞(上海吉满基因技术有限公司)；PCR用试剂primer(上海生工生物工程有限公司)；Taq polymerase(美国NEB公司)；Qiagen质粒大抽试剂盒(德国Qiagen公司)；LB培养基(Alpha Aeser)；BSA、DMSO、MgSO4、Cacl2(美国Sigma公司)；胎牛血清、DMEM、胰酶(美国Gibco公司)； 琼脂糖(美国Bio-Rad公司)；T4 DNA ligase、T4 DNA ligase buffer、DNA ladder、BamH I、EcoR I、Xba I、Xho I(Fermentas)；RIPA(强)裂解液、PMSF(100 mM)、BCA 蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)。

1.2实验方法

1.2.1CNN3过表达(CNN3-OE)慢病毒载体的制备：

1.2.1.1引物设计与合成：在NCBI中找到CNN3基因序列并确定所用载体pGMLV-PA6。引物序列上游为：5′-CCG GAATTC GCCACC ATGGAC TACAAGGACGATGACGACAAGACCCACTTCAACAA GGGCC-3′，下游为：5′-CG GGATCC CTAGTAAT CGATGCCCTGGTCG-3′，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.2.1.2构建步骤：①利用T4连接酶在22℃连接pGMLV-PA6载体与目的片段60 min。②将连接产物转化入制备好的感受态细胞对长出的单克隆菌落先进行 PCR鉴定，PCR鉴定阳性菌落进行测序鉴定。

1.2.2RNA干扰CNN3慢病毒载体的制备：

1.2.2.1CNN3基因shRNA表达模板序列设计与合成：在GenBank网站中查询到目的基因CNN3的mRNA，参考RNA干扰序列设计原则，根据我们的设计经验和设计软件进行评估测定，设计3个RNA干扰靶点序列，并合成3对shRNA寡聚单链DNA，序列如下：CNN3-ShRNA1-1：5′-gatccGCAGACTGA CAAACCCTTTGATTCAAGAGATCAAAGGGTTTGTCA GTCTGCTTTTTTg-3′，CNN3-ShRN A1-2：5′-aattcAAA AAAGCAGACTGACAAACCCTTTGATCTCTTGAATCA AAGGGTTTGTCAGTCTGCg-3′；CNN3-ShRN A2-1：5′-gatccGGAGAACATCGGCAACTTTATAGAGAACTTAT AAAGTTGCCGATGTTCTCC TTTTTTg-3′，CNN3-ShRNA2-2：5′-aattcAAAAAAGGAGAACATCGGCAAC TTTATAAGTTCTCTATAAAGTTG CCGATGTTCTCCg-3′;CNN3-ShRNA3-1：5′-gatcc GGCCAAAGTGTAA TCGGTTTAAGAGAACTTTAAACCGATTACACTTTGG CCTTTTTTg-3′,CNN3-ShRNA3-2：5′-aattcAAAAAA GGCCAAAGTGTAATCGGTTTAAAGTTCTCTTAAACC GATTACACTTTGGCCg-3′。

1.2.2.2shRNA慢病毒载体的构建与鉴定：① 用无菌的TE buffer 稀释引物使终浓度为100 μmol/L。分别吸取10 μL的上下游引物混合并吹打均匀放入PCR管内，94℃水浴缓慢退火冷却至室温。②质粒用BamH I、EcoR I双酶切，0.8%琼脂糖凝胶电泳，回收大片段。③在25℃中，利用T4连接酶将退火产物和线性化质粒载体pGMLV-SC5连接过夜。④连接产物转化至感受态细胞DH5α，经菌液PCR鉴定阳性菌落进行测序和比对分析。

1.2.3慢病毒质粒的包装和滴度测定：转染前1 d，将已经长好的293T细胞以合适的比例传代到10 cm培养皿中，转染前1～2 h将需要转染的细胞换新鲜的培养基，按shRNA转染体系：DMEM 1 mL、shRNA 10 μg、Lenti-HGMix 10 μL、HG transgene reagent 60 μL;过表达转染体系：DMEM 1 mL、过表达慢病毒质粒 10 μg、Lenti-HGMix 10 μL、HG transgene reagent 60 μL混合均匀，室温放置15～20 min，将混合液分别滴入293T细胞中，混匀后置于C02培养箱中培养。转染10～12 h后加100* enhancing buffer促进转染，接着8 h后更换新鲜培养基，继续培养48 h后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液。病毒浓缩纯化使用离心超滤装置(美国Millipore公司)，浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液，分装后保存于-80℃。取其中1支使用逐孔稀释滴度测定法进行病毒生物学滴度测定，并计算病毒滴度。

1.2.4CNN3基因沉默/过表达鼠模型的建立：

1.2.4.1实验动物：实验鼠购自成都达硕实验动物有限公司(动物生产许可证号：SCXK(川)2013-24)，均为SPF级、健康雄性Sprague Dawley(SD)大鼠，6周龄，体重180～220 g，随机分为空pGMLV-SC5载体(shRNA阴性对照)组，干扰序列1的慢病毒载体简称为shRNA1组，干扰序列2的慢病毒载体简称为shRNA2组，干扰序列3的慢病毒载体简称为shRNA3组，空pGMLV-PA6载体(过表达阴性对照)组，CNN3-OE组简称OE组。

1.2.4.2慢病毒载体转染：通过立体定位注射方法将3个CNN3-shRNA、CNN3-OE慢病毒载体及各自对照的空载体转染至各组实验鼠海马。按0.4 mL/100 g剂量的7.2%的水合氯醛注入大鼠腹腔，待麻醉生效后将大鼠头部固定在立体定位仪上，备皮、暴露骨缝，用3%的双氧水止血洗洁。参考大鼠立体定位图谱，把前囟定为零点，设定前囱后3.6 mm、中线旁开2 mm处为海马穿刺靶点。将电钻自穿刺靶点处钻开颅骨，用微量进样器抽取2 μL慢病毒浓缩液并将其在立体定位仪上固定好，自钻孔部位缓慢进针至颅骨表面下3.5 mm，匀速缓慢(0.2 μL/min)注入慢病毒载体，注射完毕后针头留置10 min，再缓慢拔出。同样的方法进行对侧海马的注射结束后缝合切口，手术后大鼠自由进食和休息。

1.2.5检测慢病毒载体转染效率：采用免疫印迹(Western blot)实验对各组慢病毒载体转染后实验鼠海马的CNN3基因调控蛋白calponin-3进行定量。首先在注射慢病毒载体后的第1、3、7、10、14天，随机从shRNA1、shRNA2、shRNA3、OE及2个对照组中抽取实验鼠处死后分离出海马，用RIPA裂解液(含PMSF，体积之比为RIPA:PMSF=100:1)按每100 mg组织加1 mL RIPA裂解液的比例，在冰上匀浆约30 min，然后4℃下12 000 r/min离心15 min取上清液，用BCA法测定蛋白浓度，使用Image J软件分析处理，取β-actin 作为内参，用calponin-3与β-actin的光密度比值表示calponin-3蛋白的相对表达量。然后通过统计学方法将3个CNN3-shRNA组和shRNA阴性对照组的实验结果进行两两比较，找出沉默大鼠海马CNN3基因的最佳shRNA干扰序列。

为明确CNN3基因沉默/过表达效果持续时长，延长转染最佳shRNA干扰和过表达慢病毒载体鼠的观察时间，在第1、2、4、6、8周时处死取材， Western blot定量检测各时间点中实验鼠海马calponin-3蛋白表达量。

1.3统计学方法

因所有试验都重复3次，为避免每次Western blot实验曝光时造成的条带深浅不一干扰，我们将3次实验结果进行归一化处理后再采用SPSS 17.0软件进行统计分析。多组多重比较使用One-way ANOVA 单因素方差分析，方差齐时使用LSD 统计方法进行组间两两比较差异有无统计学意义，P<0.05时判为差异具有统计学意义。

2结果

2.1基因测序分析

经过比对，3个shRNA重组克隆中插入的片段序列与设计的oligo序列完全一致,无碱基缺失或错误(图1A-C)，表明CNN3-shRNA1、CNN3-shRNA2和CNN3-shRNA3慢病毒载体均构建成功。CNN3-OE慢病毒载体中插入片段序列与目的片段序列完全一致，无碱基缺失或错误(图1D)，表明过表达慢病毒载体也成功构建。

注：A图为CNN3-shRNA1慢病毒载体，B图为CNN3-shRNA2慢病毒载体，C图为CNN3-shRNA3慢病毒载体，D图为CNN3-OE慢病毒载体。图1　慢病毒载体的测序结果Note. A indicates CNN3-shRNA1 vector; B indicates CNN3-shRNA2 vector; C indicates CNN3-shRNA3 vector; A indicates CNN3-OE vector. Fig.1　Sequencing results of the lentiviral vectors targeted CNN3 gene.

2.2慢病毒滴度的测定

经荧光计数法测得重组慢病毒CNN3-shRNA1、CNN3-shRNA2、CNN3-shRNA3的滴度均为2×109TU/mL，慢病毒CNN3-OE的滴度是2×108TU/mL，CNN3-shRNA和CNN3-OE的阴性对照空载体病毒的滴度均为2×108TU/mL。

2.3Western blot实验结果

首先对比了CNN3-shRNA1、CNN3-shRNA2、CNN3-shRNA3、CNN3-OE慢病毒载体与相应的对照空载体分别被转染到SD大鼠海马后1、3、7、10和14 d的calponin-3与内参的光密度比值。结果显示：与对照组相比， 转染后14 d内3个shRNA组海马的calponin-3蛋白水平均下调，尤其是在转染后第10、14和3天， shRNA1、shRNA2、shRNA3对calponin-3表达的抑制程度最高，分别达到36.78%、73.26%、39.96%，均具有统计学意义。此外， shRNA2组海马的calponin-3蛋白水平在慢病毒载体转染后呈进行性降低，而shRNA1和shRNA3组的calponin-3蛋白抑制反应不稳定(图2A-C)；过表达的OE组的calponin-3蛋白在慢病毒转染后表达水平呈进行性升高，在第14天时达到最高，较对照组升高93.88%，两组间具有显著性差异(P<0.05)(图2D)。

注：A图为CNN3-shRNA1慢病毒载体组与空pGMLV-SC5载体转染组比较；B图为CNN3-shRNA2慢病毒载体组与pGMLV-SC5载体转染组比较；C图为CNN3-shRNA3慢病毒载体组与pGMLV-SC5载体转染组比较；D图为CNN3-OE慢病毒载体组与空pGMLV-PA6载体转染组比较。左图均为代表性的Western blot结果图，右图均为统计分析结果。Ctl：阴性对照组； *：p<0.05。图2　各种慢病毒载体转染14天内后实验鼠海马calponin-3蛋白的表达变化。Note. (A) shows CNN3-shRNA1 vs. the control pGMLV-SC5 vector; (B) shows CNN3-shRNA2 vs. the control pGMLV-SC5 vector; (C) shows CNN3-shRNA3 vs. the control pGMLV-SC5 vector; (D) shows CNN3-OE vs. the control pGMLV-PA6 vector. The left figures show the representative results of Western blot. The right figures are the results of statistical analysis. Ctl: negative control; *：P<0.05.Fig.2　Changes of the expression of calponin-3 protein in the hippocampus of rats within 14 days after transfection with various lentiviral vectors targeted CNN3 gene.

基于14 d内针对CNN3基因ShRNA2组和OE组的calponin-3蛋白降解/上调幅度最大，均明显超过50%，而且此效应似与时长呈负/正相关(图2B, 2D)，因此将这两组的观察时间延长至转染后8周。结果显示，CNN3-ShRNA2慢病毒载体对CNN3基因的抑制效果可持续到8周，且各时间点的calponin-3蛋白变化差异均具有显著性。CNN3-OE慢病毒载体的过表达效果也可持续8周，但统计学分析结果显示仅在第14天时过表达效应与对照组相比具有显著性差异(图3)。

注：A图为CNN3-shRNA2慢病毒载体组与空pGMLV-SC5载体转染组比较；B图为CNN3-OE慢病毒载体组与空pGMLV-PA6载体转染组比较。左图均为代表性的Western blot结果图，右图均为统计分析结果。 Ctl：阴性对照组； *：p<0.05。图3　CNN3-shRNA2和CNN3-OE慢病毒载体转染1～8周后calponin-3蛋白的表达变化。Note. (A) shows CNN3- shRNA2 vs. the control pGMLV-SC5 vector; (B) shows CNN3-OE vs. the control pGMLV-PA6 vector. The left figures show the representative results of Western blot. The right figures are the results of statistical analysis. Ctl: negative control; *：P<0.05.Fig.3　Changes of the expression of calponin-3 protein in the hippocampus of rats from 1-8 weeks after transfection with the lentiviral vectors of CNN3-shRNA2 or CNN3-OE.

3讨论

自CNN3基因及其编码蛋白calponin-3被发现以来，各国研究者开展了机制研究，但除Flemming等采用基因敲除鼠研究B细胞发育[5]外，其余都是构建慢病毒载体后转染神经元、表皮成纤维母细胞、胎盘滋养层、肌原细胞等细胞模型[2-4，10]。然而脑部结构相当复杂，仅脑细胞就有上百亿，脑细胞又分为神经元和神经胶质细胞两大类，相互之间还形成多种已知和未知的功能连接，所以仅有神经元模型远不能满足基因功能研究的需要，还需建立实验动物模型以模拟各种生理病理过程[12,13]。在本研究中，我们设计、构建大鼠CNN3基因的沉默及过表达慢病毒载体后，在立体定位仪引导下进行活体定位注射，使大鼠海马calponin-3蛋白表达水平显著下降/上调50%以上，且这种高效的干扰效应一直持续到第8周，表明该技术完全适用于动物模型的基因功能研究。

脂质体法、电转法和以腺病毒或慢病毒为载体的感染法是将外源性基因导入体外培养细胞的4种常用方法。脂质体法、电转法和腺病毒载体感染法这3种方法在原代细胞、干细胞、悬浮细胞中的感染效率极低，而且仅能瞬时感染，无法使目的基因在目的细胞持久表达或维持干扰的效果，故不适用于体内实验。而慢病毒载体的出现较好地解决了上述问题：首先，慢病毒对神经元等非常难转染的细胞依旧有较高的转染效率；其次，慢病毒载体上含有抗生素标记基因，通过抗生素筛选即可获得稳定株，利于下游实验的进行；更为重要的是，慢病毒可将外源性基因有效地整合到宿主染色体上从而达到持久性表达，适合活体动物模型的基因操作，因此尽管我们选择的CNN3基因靶点序列和其他课题组报道的都不一样，但是将其克隆入shRNA/过表达慢病毒载体后，均成功沉默/上调大鼠脑内CNN3基因，而且在转染后8周基因沉默/过表达的效应仍持续存在，为后续实验提供稳定的CNN3基因干扰动物模型。此外，与基因敲除/敲入通过改变DNA序列来达到基因功能的“全或无”不同[14]，基因沉默/过表达技术不改变DNA序列，可将基因水平调控在更多水平，最重要的是该技术操作更简单、费用更低,对开展基因功能学的动物研究和开辟新的基因治疗方法更为实用。

参考文献：

[1]Maguchi M, Nishida W, Kohara K, et al. Molecular cloning and gene mapping of human basic and acidic calponins [J]. Biochem Biophys Res Commun, 1995, 217(1): 238-244.

[2]Shibukawa Y, Yamazaki N, Daimon E, et al.Rock-dependent calponin 3 phosphorylation regulates myoblast fusion [J]. Exp Cell Res, 2013, 319(5): 633-648.

[3]Shibukawa Y, Yamazaki N, Kumasawa K, et al. Calponin 3 regulates actin cytoskeleton rearrangement in trophoblastic cell fusion [J]. Mol Biol Cell, 2010, 21(22): 3973-3984.

[4]Daimon E, Shibukawa Y, Wada Y. Calponin 3 regulates stress fiber formation in dermal fibroblasts during wound healing [J]. Arch Dermatol Res, 2013, 305(7): 571-584.

[5]Flemming A, Huang QQ, Jin JP, et al. A conditional knockout mouse model reveals that calponin-3 is dispensable for early B cell development [J]. Plos ONE, 2015, 10(6): e0128385.

[6]Rozenblum G T, Gimona M. Calponins: adaptable modular regulators of the actin cytoskeleton [J]. Int J Biochem Cell Biol, 2008, 40(10): 1990-1995.

[7]Trabelsiterzidis H, Fattoum AA, Dessi F, et al. Expression of an acidic isoform of calponin in rat brain: western blots on one- or two-dimensional gels and immuno-localization in cultured cells [J]. Biochem J, 1995, 306: 211-215.

[8]Kreipke CW, Rafols JA. Calponin control of cerebrovascular reactivity: therapeutic implications in brain trauma [J]. J Cell Mol Med, 2009, 13(2): 262-269.

[9]Ferhat L, Esclapez M, Represa A, et al. Increased levels of acidic calponin during dendritic spine plasticity after pilocarpin-induced seizures [J]. Hippocampus, 2003, 13(7): 845-858.

[10]Rami G, Caillard O, Medina I, et al. Change in the shape and density of dendritic spines caused by overexpression of acidic calponin in cultured hippocampal neurons [J]. Hippocampus, 2006, 16(2): 183-197.

[11]Han Y, Yin H, Xu Y, et al. Increased expression of calponin-3 in epileptic patients and experimental rats [J]. Exp Neurol, 2012, 233(1): 430-437.

[12]Tsai HH, Li HL, Luis C, et al. Regional astrocyte allocation regulates CNS synaptogenesis and repair [J]. Science, 2012, 337(6092): 358-362.

[13]Molofsky AV, Kelley KW, Tsai HH, et al. Astrocyte-encoded positional cues maintain sensorimotor circuit integrity [J]. Nature, 2014, 509(7499): 189-194.

[14]石宏, 何伟, 王晓宇, 等. TRPV1和ASIC3基因敲除小鼠的寿命观察 [J]. 中国比较医学杂志, 2014,24(10): 78-81.

〔修回日期〕2015-11-23

Construction and identification of lentivirus-mediated vectors targeting CNN3 gene in the rat hippocampus

SUN Jun-mei1, LONG Jing-jing1, HAN Yan-bing1, CAI Xue-mei2, LU Di3, BIAN Li-gong3, GUO ia-Zhi3, LI Mei1

(1. Department of Neurology, 2. Department of Clinical Laboratory,First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming, 650031, China;3. Biomedical Engineering Research Center, Kunming Medical University, Kunming, 650500)

【Abstract】ObjectiveTo establish a method focusing on regulation of CNN3 gene in the rat hippocampus and help to explore the role of CNN3 gene played in the brain physiology and pathology. Methods One cDNA sequence and three shRNAs targeting CNN3 gene were designed and synthesized. The recombinant lentivirus-mediated expressing and three short hairpin RNA (shRNA) vectors targeting CNN3 gene in the rats were constructed with engineering technology. All recombinant vectors were intravenously injected into rats hippocampi guided by stereotaxic apparatus. Western blot was performed to explore the best shRNA and to study the changes of CNN3 gene in the rat hippocampus after transfection with the silence and over-expressed vectors. ResultsThe lentivirus-mediated vector expressing CNN3-OE and three shRNA vectors targeting CNN3 gene were successfully constructed. Within eight weeks after transfection, the vectors of CNN3-OE and three CNN3-shRNAs changed the expression of CNN3 gene in the rat hippocampus, in particular, all the protein levels of calponin-3 encoded by CNN3 gene were significantly down-regulated along with the time, with the highest inhibitory rate of 73.6% in the CNN3-shRNA2 group. Significant up-regulation of calponin-3 protein level by 93.88%, was found only on the 14th day after transfection. ConclusionsLentivirus-mediated vectors of CNN3-OE and CNN3-shRNAs may regulate in vivo the CNN3 gene level in the local brain region of rats via stereotactic injection.The study lays a foundation for disease prevention and treatment in the future.

【Key words】CNN3; Gene; Silencing; Recombination; Lentiviral vector

doi:10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.02.012

【中图分类号】R-33

【文献标识码】A

【文章编号】1671-7856(2016) 02-0055-07

[作者简介]孙俊梅(1989-)，女，研究生，专业：神经病学。E-mail: 675181708@QQ.com。[通讯作者]韩雁冰(1972-)，女，副主任医师，硕士生导师，研究方向：癫痫的发病机制和临床防治。E-mail: ynhyb@163.com。

[基金项目]国家自然科学基金地区基金(81260199)；云南省科技厅-昆明医科大学联合基金(2012FB030)；云南省卫生科技计划项目(2012WS0002)。