副溶血性弧菌实时荧光单引物等温扩增方法的建立

王建昌， 胡连霞， 段永生， 李 静， 王金凤

（河北出入境检验检疫局 检验检疫技术中心，河北 石家庄050051）

副溶血性弧菌实时荧光单引物等温扩增方法的建立

王建昌， 胡连霞*， 段永生， 李 静， 王金凤

（河北出入境检验检疫局 检验检疫技术中心，河北 石家庄050051）

以副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）gyrB基因特异序列为靶序列，设计RNA-DNA组合引物和链终止序列，优化反应体系，建立实时荧光单引物等温扩增（Real-time fluorescence single primer isothermal amplification，实时荧光SPIA）检测副溶血性弧菌的方法。实时荧光SPIA在40 min反应时间内，对3株副溶血性弧菌和16株其他食源性致病菌进行实时荧光SPIA检测，结果表明除3株副溶血性弧菌外，其他细菌均未扩增出荧光曲线。进一步研究表明，实时荧光SPIA检测副溶血性弧菌纯培养DNA的灵敏度为8.2 fg/μL，对副溶血性弧菌菌悬液的检测灵敏度为13.5 CFU/mL；对鳕鱼、海蟹、牡蛎和咸鸭蛋等4种模拟样品中副溶血性弧菌的检出限均为14.7 CFU/g。研究结果表明，实时荧光SPIA检测副溶血性弧菌灵敏度高，特异性强，耗时短，方法简便。

实时荧光单引物等温扩增；副溶血性弧菌；gyrB基因

致病性弧菌是一类重要的食源性病原菌[1-2]，广泛地存在于自然水环境，特别是海水中，对海产品有较大程度的污染。在弧菌属中，危害较大或出现频率较高的是O1型霍乱弧菌、副溶血性弧菌和创伤弧菌[3-4]。副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VP）最早是由Fujino等[5]于1953年从日本一个食物中毒患者初次分离得到的，是一种革兰氏阴性嗜盐菌，常呈多态性，有鞭毛，无荚膜和芽孢。在含3%～5%的食盐培养基中，pH 7.5～8.5，37℃条件下生长最为良好并且对酸敏感。人食用污染有该菌的海产品后可引起急性胃肠炎，严重时还可引起败血症[6]。目前，在中国沿海地区的食物中毒病例中，副溶血性弧菌已成为微生物性食物中毒的首要病原菌[7]。快速准确地从海产食品中鉴定副溶血性弧菌，具有重要的医学意义。

目前，食品中副溶血性弧菌检验主要依据GB 4789.7-2013，SN/T 0173-2010[8-9]对食品中的副溶血性弧菌进行检测，大约需要3～7 d的时间，且容易出现交叉污染和假阳性。分子生物学技术具有快速、直观、准确等优势，已在副溶血性弧菌检测中得到广泛应用[10-12]。随着食品安全检测标准的提高，寻找更加快速、准确、便捷的检测技术显得至关重要。

编码促旋酶的 gyrB基因是单拷贝的看家基因，全长约为1.2～1.4 kb，平均碱基替换率为每100万年变化0.7%～0.8%，比16S rDNA的每5 000万年变化1%的速度快[13]。另外，由于其作为蛋白编码基因，其所固有的遗传密码子的兼并性使得DNA序列可以发生较多的变异而不改变氨基酸序列，尤其是密码子的第3位碱基，这就使得gyrB基因序列在区分和鉴定细菌近缘种方面[14]，比非蛋白编码基因16S rDNA具有更高的分辨率。

单引物等温扩增技术 （Single primer isothermal amplification，SPIA）是近年报道的一种新型线性核酸等温扩增技术[15]。该技术主要是通过一条3’端是DNA片段、5’端是RNA片段的组合引物、RNase H及具有强链置换活性的DNA聚合酶实现DNA的体外线性等温扩增，经过RNA降解、新引物结合、链置换的循环过程，实现模板互补序列的快速扩增，最终扩增出大量的具有高度忠实性的cDNA单链[16]。

作者在普通SPIA的基础上，以副溶血性弧菌gyrB为靶基因，设计RNA-DNA组合引物和链终止序列，在单引物等温扩增技术（SPIA）的基础上加入荧光染料SYBER GreenⅡ，建立了实时荧光单引物等温扩增（Real-time fluorescence SPIA）检测副溶血性弧菌的方法。通过实时荧光分析仪对荧光信号进行实时检测，具有操作简单、耗时短、实时监控等优点。目前国内外关于SPIA方法的报道比较少，实时荧光单引物等温扩增方法更未见到报道。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株 3株副溶血性弧菌和16株非副溶血性弧菌：分别购自美国典型菌种保藏中心（ATCC）、中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）、中国医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC）；菌株2为河北国际旅行卫生保健中心赠送；菌株3为参加CNCA能力验证时分离。具体信息如表1所示。

1.1.2 主要试剂 BstDNA聚合酶、RNase H、RNA酶抑制剂、Mgcl2、dNTPs、SYBER GreenⅡ等购自于上海生工生物工程有限公司；基因组DNA提取试剂盒：购自北京天根生化科技有限公司；培养基：购自北京陆桥有限责任公司；鳕鱼、海蟹、牡蛎和咸鸭蛋样品：购自当地超市。

1.1.3 主要设备 ABI7500实时荧光PCR仪：美国AB公司产品；PCR扩增仪 （Whatman T Gradient基因扩增仪）：德国Biometra公司产品；核酸蛋白分析仪（Eppendorf Biophotometer plus）：德国 Eppendorf公司产品。

1.1.4 RNA/DNA组合引物和Blocker的设计和合成 根据Genebank中副溶血性弧菌gyrB基因 （基因号：KC542972.1）己知序列，对其进行同源性分析，确定其保守序列，用Primer premier5.0设计组合引物和相应链终止序列，如表2所示。组合引物和Blocker由大连TAKARA公司合成。

1.2 试验方法

1.2.1 副溶血性弧菌的培养 取保藏的副溶血性弧菌在CHROMID VIBRIO弧菌显色培养基上进行划线，恒温箱36℃培养12 h，传代培养2次。挑取单菌落接种至新鲜无菌的SPB肉汤中，36℃过夜培养。

1.2.2 副溶血性弧菌基因组DNA的提取 采用普通热裂解法[17]、蛋白酶K法[18]、饱和酚提取法[19]和天根试剂盒法对纯培养的副溶血性弧菌进行基因组DNA的提取，并测定浓度。

1.2.3 副溶血性弧菌实时荧光SPIA反应体系和反应条件的建立 建立副溶血性弧菌实时荧光SPIA检测25 μL反应体系，优化反应体系中RNA/DNA组合引物以期确定各组分的最佳工作浓度，建立副溶血性弧菌实时荧光SPIA最佳反应体系。

将副溶血性弧菌基因组DNA模板、组合引物、Blocker及反应缓冲液的混合液经99℃，90 s处理后降温至60℃，迅速加入RNase H和Bst DNA聚合酶，在ABI7500实时荧光PCR仪上55~65℃，反应30~60 min（每循环30 s），反应过程中实时监测荧光信号，以期确定最佳反应温度和时间，建立副溶血性弧菌实时荧光SPIA检测方法。

1.2.4 副溶血性弧菌实时荧光SPIA检测方法的特异性分析 取表1中19株过夜培养菌悬液1 mL，用热裂解法提取基因组DNA作为模板，根据1.2.3中所建立的反应体系和条件进行检测，对所建立的实时荧光SPIA方法进行特异性分析。

1.2.5 不同模板DNA提取方法对副溶血性弧菌实时荧光SPIA检测结果的影响 使用1.2.2中4种方法提取副溶血性弧菌基因组DNA，作为模板进行实时荧光SPIA检测，以分析不同的DNA提取方法对检测结果的影响。

1.2.6 副溶血性弧菌实时荧光SPIA检测方法的灵敏性分析 挑取显色培养基上36℃培养12 h的单菌落，制备成一定浓度菌悬液。用生理盐水进行10倍系列稀释，采用稀释平板法，测定其纯培养物活菌数为1.35×108CFU/mL；同时取1 mL上述菌悬液直接用热裂解法提取副溶血性弧菌基因组DNA，测得DNA质量浓度为82 ng/μL，用灭菌DEPC水进行10倍系列稀释，进行SPIA灵敏性试验。

1.2.7 副溶血性弧菌实时荧光SPIA检测方法在模拟样品中检出限分析 在鳕鱼、海蟹、牡蛎和咸鸭蛋样品中分别添加副溶血性弧菌作为模拟污染样品进行检出限分析。进行添加前，鳕鱼、海蟹、牡蛎和咸鸭蛋样品已按GB 4789.7-2013常规检验法证实副溶血性弧菌阴性。挑取显色培养基上36℃培养12 h的单菌落，制备成一定浓度菌悬液，用生理盐水进行10倍系列稀释后，选取系列稀释浓度

菌悬液1 mL分别添加到各个样品匀浆中（10 g样品于90 mL质量分数3%氯化钠碱性蛋白胨水中）。混匀，分别取1 mL模拟样品，采用稀释平板法，测定其活菌添加范围为 1.47×105~1.47×10-2CFU/mL。同时分别取1 mL模拟样品，直接用热裂解法提取副溶血性弧菌基因组DNA，进行副溶血性弧菌实时荧光SPIA方法对模拟污染鳕鱼样品的检出限分析。

2 结果与分析

2.1 副溶血性弧菌实时荧光SPIA反应体系和反应条件的建立

如图1所示，经过各种反应体系和条件的优化，设计合成的组合引物及Blocker（Pvrn+Bv）对副溶血性弧菌出现扩增曲线，且最佳反应体系为：RNA/DNA 组 合 Pirmer 5.6 μmol/L、Blocker 1.0 μmol/L、10×Bst Buffer 2.5 μL、Bst DNA polymerase 12 U、10×RNaseH Buffer 2.5μL、RNaseH 5 U、dNTPs 0.2 μmol/L、Mgcl25.0 μmol/L、RNase Inhibitor 16 U、DNA模板1 μL、SYBER GreenⅡ0.5 μL（300×稀释），其余用灭菌DEPC水补足体系；最佳反应条件为57.0℃，反应40 min。

2.2 副溶血性弧菌实时荧光SPIA检测方法的特异性分析

特异性试验结果显示，仅副溶血性弧菌出现典型的荧光扩增曲线，其他细菌检测均未产生扩增曲线，结果如图2所示。结果表明作者建立的检测方法具有良好的特异性。

2.3 不同模板DNA提取方法对副溶血性弧菌实时荧光SPIA检测结果的影响

如图3所示，使用所建立的副溶血性弧菌实时荧光SPIA检测方法对4种不同方法提取的模板DNA进行检测，均出现典型的扩增曲线，Ct值（起峰时间）没有明显差异。结果表明，该方法检测副溶血性弧菌时对模板质量要求不苛刻，能适应广大的基层和现场检测。

2.4 副溶血性弧菌实时荧光SPIA检测方法的灵敏性试验

如图4所示，当DNA模板用量为8.2×103~8.2 fg/μL时，即副溶血性弧菌浓度为1.35×103~1.35CFU/mL时，均出现典型的扩增曲线；当模板用量为0.82 fg/μL时，即副溶血性弧菌浓度为1.35 CFU/mL则无扩增曲线。该方法对副溶血性弧菌DNA的检测灵敏度为8.2 fg/μL，对菌液的检测灵敏度为1.35 CFU/mL。

2.5 副溶血性弧菌实时荧光SPIA检测方法在模拟样品中的检出限试验

对鳕鱼、海蟹、牡蛎和咸鸭蛋4种样品中人工添加的副溶血性弧菌进行了检测。当4种样品中副溶血性弧菌添加浓度为1.47×103~1.47 CFU/g时，均出现典型的扩增曲线，其平均Ct值如表3所示；当4种样品中副溶血性弧菌添加浓度为1.47 CFU/g时，则均无扩增曲线。结果表明，该方法在鳕鱼、海蟹、牡蛎和咸鸭蛋4种模拟样品中检出限均为14.7 CFU/g。3次重复试验结果一致。

3 结语

侯晓丽等[20]对霍乱弧菌和副溶血弧菌分离菌株gyrB基因的系统发育关系分析，发现该区段的基因可以明显区别开不同的菌株。Venkateswaran等[21]通过对1 258 bp的gyrB基因序列分析发现，副溶血性弧菌与溶藻弧菌的gyrB的相似率仅为86.8%，可以明显区分出这两种致病菌。Vuddhakul等[22]分析发现副溶血弧菌与霍氏弧菌gyrB基的相似率为80%，可明显看出两者不同，而且用 PCR方法便可从其他菌中将霍氏弧菌鉴别出来。Kumar等[23]使用创伤弧菌的gyrB基因序列，设计特异引物可以快速准确地将该菌与其他种的弧菌或者非弧菌类微生物区分开，为该菌的检测提供了便捷的方法。作者将副溶血性弧菌gyrB基因进行比对，找到保守序列设计组合引物和链终止序列，将副溶血性弧菌从其它弧菌中鉴定出来，特异性强。

作者建立的副溶血性弧菌实时荧光SPIA方法具有很好的敏感性和特异性，同时对模板DNA要求较低。

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Real-Time Fluorescence Single Primer Isothermal Amplification Established for the Vibrio parahaemolyticus Detection

WANG Jianchang， HU Lianxia*， DUAN Yongsheng， LI Jing， WANG Jinfeng
（The Technical Center of Inspection and Quarantine，Hebei Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Shijiazhuang 050051，China）

The RNA-DNA primers and blockers were designed and synthesized based on the Vibrio parahaemolyticus gyrB gene.The reaction system was optimized.The real-time fluorescence single primer isothermal amplification （real-time fluorescence SPIA）was established for the detection of Vibrio parahaemolyticus.The typical fluorescence curves were observed for only 3 strains of Vibrio parahaemolyticus in the real-time fluorescent SPIA detection of 3 strains of Vibrio parahaemolyticus and 16 strains of other food borne bacteria within 40 mins.Further studies showed that the sensitivity of real-time fluorescent SPIA for the detection of Vibrio parahaemolyticus DNA in pure culture was 8.2 fg/μL，while 1.35×101CFU/mL for Vibrio parahaemolyticus bacteria suspension and 14.7 CFU/g for Vibrio parahaemolyticus in four simulated sample of codfish，crab，oysters and salted duck egg.The real-time fluorescence SPIA detection was demonstrated as a convenient method for the detection of Vibrio parahaemolyticus with high sensitivity，strong specificity and time saving.

real-time fluorescence SPIA，Vibrio parahaemolyticus，gyrB gene

TS 254.7

A

1673—1689（2016）11—1212—07

2015-01-14

国家质检公益性科研专项项目（201210128；201310126）。

王建昌（1981—），男，山东临朐人，农学博士，高级兽医师，主要从事动物疫病病原、食源性致病菌的分子生物学检测研究。E-mail：jianchangwang1225@126.com

*通信作者：胡连霞（1972—），女，河北石家庄人，高级工程师，主要从事有害微生物检测控制研究。E-mail：hulianxia168@163.com