Cry1C蛋白对4种棉花害虫的致死效果

吕丽敏， 张　帅， 雒珺瑜， 王春义， 朱香镇， 王　丽， 张利娟， 崔金杰

中国农业科学院棉花研究所/棉花生物学国家重点实验室，河南 安阳 455000



Cry1C蛋白对4种棉花害虫的致死效果

吕丽敏， 张帅， 雒珺瑜， 王春义， 朱香镇， 王丽， 张利娟， 崔金杰*

中国农业科学院棉花研究所/棉花生物学国家重点实验室，河南 安阳 455000

摘要:【背景】苏云金芽胞杆菌(Bt)属革兰氏阳性细菌，是目前世界上应用最广泛的杀虫剂。来自Bt的Cry1Ac基因自1997年商业化以来，其产生的蛋白对棉铃虫、红铃虫等鳞翅目害虫起到了很好的控制作用。但该基因对甜菜夜蛾、斜纹夜蛾、玉米螟等害虫的控制作用较差，因此，需要寻找新的Bt基因亚型控制上述害虫。【方法】将Cry1C蛋白加到人工饲料上形成药膜后，接入低龄幼虫进行生物测定，以常规不加毒蛋白的饲料为对照，计算1、3、5、7 d后不同害虫的校正死亡率。【结果】随着Cry1C蛋白浓度的增加及时间的延长，甜菜夜蛾和斜纹夜蛾的校正死亡率逐渐升高，Cry1C浓度为10 μg·mL-1时，处理7 d后，甜菜夜蛾和斜纹夜蛾的校正死亡率分别为100%和85.42%，表明甜菜夜蛾比斜纹夜蛾更敏感，而棉铃虫和玉米螟对Cry1C蛋白的敏感性较差。【结论与意义】Cry1C基因可作为控制棉田甜菜夜蛾和斜纹夜蛾的有价值的候选基因，但是对棉铃虫和玉米螟无效。该研究为筛选新的Bt基因亚型用于防治不同的棉花害虫提供了数据参考。

关键词:Cry1C蛋白； 甜菜夜蛾； 斜纹夜蛾； 玉米螟； 棉铃虫

苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis，Bt)属革兰氏阳性细菌，是目前世界上应用最广泛的杀虫剂。该菌株能够产生伴孢晶体蛋白，又称杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal protein， ICP)或δ-内毒素；该毒素对鳞翅目、膜翅目、鞘翅目、双翅目、直翅目、 半翅目、食毛目等多种昆虫，以及螨类、线虫和原生动物等都具有特异的杀虫活性(Schnepfetal.,1998)。

我国棉花害虫共有300多种，其中常发性害虫30多种，包括鳞翅目、膜翅目、鞘翅目等(中国农业科学院棉花研究所，2013)。1997年转Bt(Cry1Ac)基因棉花开始商品化种植，有效控制了棉铃虫的暴发为害(吴孔明，2007)。转Bt(Cry1Ac)基因对棉铃虫大范围控制后，棉田其他害虫如甜菜夜蛾Spodopteraexigua(Hübner)、斜纹夜蛾Prodenialitura(Fabricius)、玉米螟Pyraustanubilalis(Hübern)等对棉花的危害也需引起重视；其中，甜菜夜蛾于2001年在中国被列入重要害虫的潜在暴发名单(石宏等，2006； Wuetal.,2009)。因此，在保证Bt(Cry1Ac)基因继续发挥作用的同时，需要不断挖掘寻找新的基因以防止上述害虫对棉花造成新的更大危害，保证棉花产业的健康发展(王庆龙等,1986； 杨进等,2010)。挖掘的新基因在利用前首先要进行安全评价，旨在探明其对环境可能造成的影响。据报道(吕玲玲，2006； 王庆龙等,1986)，Cry1C基因被转入到蔬菜作物后，对甜菜夜蛾的控制作用较好。此外，该基因还对伯莎夜蛾MamestraconfigurataWalker(Hernndez-Martínezetal.,2008)、小菜蛾PlutellaxylostellaL.(Massonetal.,1998)、粉纹夜蛾Trichoplusiani(Hübner) (Tabashniketal.,2000)等有较好的控制作用。但是该基因转入棉花后的控制效果还未知。

本研究将不同浓度的Cry1C蛋白加到人工饲料中，通过室内试验评价Cry1C对甜菜夜蛾、斜纹夜蛾、棉铃虫和玉米螟低龄幼虫的控制作用，旨在为转基因棉花筛选新的基因提供数据参考。

1材料与方法

1.1试虫

选取棉铃虫、甜菜夜蛾、斜纹夜蛾和玉米螟为供试昆虫；昆虫龄期均为1日龄。4种昆虫均为本实验室饲养的敏感品系。

1.2人工饲料

人工饲料配方参照胡凤林等(2008)、黄艳君和浦冠勤(2011) 、卢美光等(1999)和周大荣等(1980)改进而成。

1.3Cry1C纯蛋白

Cry1C纯蛋白购自Sigama公司，-20 ℃冰箱保存备用。

1.4试验方法

饲料制备：按照每种昆虫的人工饲料配方，称取各个饲料组分，混合均匀、熬制，将饲料倒入24孔生测板，倒入时要不断地水平摇动，保证表面平滑。配制含Cry1C蛋白的溶液，浓度分别为0.31、0.63、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 μg·mL-1，以加100 μL的无菌水作对照。待饲料凝固后向每个孔中加入Cry1C蛋白溶液100 μL，过夜放置，使毒蛋白溶液渗入饲料中。

接虫：用毛笔将1龄幼虫轻轻挑入24孔生测盒，每个孔接1头虫，以不加入毒蛋白饲料为对照，每板为1个重复，共3次重复。用盖子封好，防止逃逸。将接虫的24孔盒放到养虫室培养(L∶D=14 h∶10 h， 温度26 ℃，相对湿度70%)。

结果记录：每隔1 d调查死亡虫口数。分别记录接虫后1、3、5、7 d后不同处理中害虫的死亡情况，计算校正死亡率。

1.5数据处理

死亡率(%)=死亡虫数/接虫数×100；校正死亡率(%)=(处理组死亡率-对照组死亡率)/(1-对照组死亡率)×100。

数据处理和方差计算利用Excel办公软件、DPS 7.0和SPSS软件进行。

2结果与分析

2.1Cry1C毒蛋白对甜菜夜蛾的致死效果

Cry1C毒蛋白对甜菜夜蛾1龄幼虫的生物测定结果见表1。随着Cry1C毒蛋白浓度的升高，甜菜夜蛾幼虫校正死亡率明显上升。方差分析结果表明，处理后1 d，甜菜夜蛾的校正死亡率差异不显著。处理后3 d，Cry1C浓度为5.0 μg·mL-1时，校正死亡率为48.49%；处理后5 d，Cry1C浓度为1.25 μg·mL-1时，校正死亡率为70.69%；处理后7 d，Cry1C的浓度为1.25 μg·mL-1时，校正死亡率为94.00%，以上差异均达到显著水平。因此，甜菜夜蛾对Cyr1C的敏感性测定的时间点应选择为5 d。

2.2Cry1C毒蛋白对斜纹夜蛾的致死效果

不同浓度的Cry1C对斜纹夜蛾的致死效果见表2。在同一浓度条件下，随着处理时间的延长，斜纹夜蛾的死亡率逐渐上升；在相同的调查时间下，随着Cry1C毒蛋白浓度的增大，斜纹夜蛾的死亡率逐渐增加。在处理后1、3 d，当Cry1C浓度为2.50 μg·mL-1时，校正死亡率差异达显著水平；处理后5 d，Cry1C的浓度为1.25 μg·mL-1时，校正死亡率为60.72%，以及处理后7 d，Cry1C的浓度为5.00 μg·mL-1时，校正死亡率为75.00%，差异均达显著水平。因此，斜纹夜蛾对Cyr1C的敏感性测定的时间点应选择为5 d。

同列数据后附不同大、小写字母者分别表示经Duncan氏法多重比较在0.01、0.05水平上差异显著。

Different capital and small letters represent significant differences among treatments at 0.01 and 0.05 level respectively when using a Duncan′s multiple ranging test.

同列数据后附不同大、小写字母者分别表示经Duncan氏法多重比较在0.01、0.05水平上差异显著。

Different capital and small letters represent significant differences among treatments at 0.01 and 0.05 level respectively when using a Duncan′s multiple ranging test.

2.3Cry1C毒蛋白对棉铃虫和玉米螟的致死效果

对棉铃虫生物测定结果见表3。Cry1C毒蛋白对棉铃虫的致死效果较差。不同处理天数的调查结果表明，随着Cry1C浓度的升高，对棉铃虫的致死作用不明显；在相同调查时间不同毒蛋白浓度处理下，该毒素对棉铃虫的校正死亡率的差异均未达显著水平。

对玉米螟的生物测定结果如表4所示。Cry1C对玉米螟的致死效果较差。不同处理时间的调查结果表明，玉米螟的校正死亡率并未随浓度的升高呈现有规律的升高，其不同浓度处理之间的校正死亡率差异不显著。

以上结果表明，棉铃虫和玉米螟作为Cyr1C毒蛋白的靶标昆虫并不适合，即该毒蛋白的基因并不能作为控制鳞翅目害虫棉铃虫和玉米螟的外源基因转入受体植物。

3讨论

本研究将不同浓度的Cry1C毒素加到人工饲料上饲喂甜菜夜蛾、棉铃虫、斜纹夜蛾和玉米螟等4种为害棉花的害虫，通过计算不同昆虫在不同浓度Cry1C以及不同处理时间下对应的校正死亡率，评价4种昆虫对Cry1C毒素的敏感性，从而筛选Cry1C的靶标害虫，为选择新的基因通过转化的方法控制以上棉花害虫提供先期评价数据。试验结果表明，甜菜夜蛾对Cry1C毒蛋白最敏感，在10 μg·mL-1Cry1C浓度条件下处理5 d，甜菜夜蛾的校正死亡率达到96.55%；斜纹夜蛾的校正死亡率为78.57%，对该毒素的敏感性次之；而Cry1C对棉铃虫和玉米螟的致死作用较差。

同列数据后附不同大、小写字母者分别表示经Duncan氏法多重比较在0.01、0.05水平上差异显著。

Different capital and small letters represent significant differences among treatments at 0.01 and 0.05 level respectively when using a Duncan′s multiple ranging test.

同列数据后附不同大、小写字母者分别表示经Duncan氏法多重比较在0.01、0.05水平上差异显著。

Different capital and small letters represent significant differences among treatments at 0.01 and 0.05 level respectively when using a Duncan′s multiple ranging test.

曾晓慧等(1999)研究了苏云金杆菌Cry1C 毒素对甜菜夜蛾幼虫生长发育、存活及取食行为的影响，当饲料中毒素浓度增高时, 幼虫历期延长， 存活率降低，对饲料的拒食作用和选择作用增强，取食量和生长量减少。本试验研究了Cry1C毒蛋白对甜菜夜蛾存活情况的影响，结果与其一致，说明Cry1C基因作为遗传转化材料来控制甜菜夜蛾危害有潜在的利用价值。此外，试验还研究了该毒素对棉铃虫的致死效果，结果表明，Cry1C毒蛋白对棉铃虫的效果较差。目前，已经商业化的转基因棉花转入的Bt基因为Cry1Ac/Ab融合蛋白，若转基因棉花能同时控制棉铃虫和甜菜夜蛾等多种害虫，构建双价的转基因体系最为可行，可实现同时控制2种或多种靶标害虫的目的。但是还需评价Cry1Ac/Ab和Cry1C基因同时利用时，是否会有效果的叠加。

本试验还研究了Cry1C毒素对斜纹夜蛾和玉米螟的致死效果，该毒素对斜纹夜蛾有一定的致死作用，而对玉米螟几乎无效；因此，可以把Cry1C基因用于辅助控制斜纹夜蛾。长期以来，玉米螟在棉花上也是一种重要害虫，并对棉花产生较重的为害(刘立春等，1996； 杨益众等,1996)。试验探讨了Cry1C毒素对玉米螟的控制效果，但结果并不理想，说明玉米螟不是该毒素的靶标害虫。目前已有报道，将经过改良的Cry1C*转入受体玉米对玉米螟有较好的控制作用(Duetal.,2014)。因此，可尝试将该基因转入棉花，形成双价或多加价抗虫棉花，实现抗多种害虫的目的。但是转入的多个基因之间是有无拮抗作用还需进一步试验研究。

参考文献

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卢美光, 范贤林, 魏岑, 1999. 棉铃虫人工饲料的改进与应用. 植物保护, 25(4): 53-54.

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曾晓慧， 喻子牛， 胡萃, 1999. 苏云金杆菌Cry1C毒素对甜菜夜蛾幼虫生长发育、存活及取食行为的影响. 浙江农业大学学报， 25(1): 62-66.

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Du D X, Geng C J, Zhang X B, Zhang Z X, Zheng Y L, Zhang F D, Lin Y J and Qiu F Z， 2014. Transgenic maize lines expressing acry1C*gene are resistant to insect pests.PlantMolecularBiologyReporter, 32(2): 549-557.

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(责任编辑:郭莹)

The controlling effect of Cry1C protein on four species of cotton insect pest

Li-min LÜ , Shuai ZHANG, Jun-yu LUO, Chun-yi WANG, Xiang-zhen ZHU,Li WANG, Li-juan ZHANG, Jin-jie CUI*

StateKeyLaboratoryofCottonBiology/InstituteofCottonResearch,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Anyang,Henan455000,China

Abstract:【Background】Bacillusthuringiensis(Bt) is a Gram-positive bacterium that is used as a biological pesticide world-wide.Cry1Acgene fromBthas been commercialized since 1997, and has been able to control cotton bollworm and pink bollworm. However,Cry1Acgene is not as good to controlSpodopteraexigua,Prodenialitura,Pyraustanubilalis, etc. Therefore, it is necessary to search for a new gene isoform ofBtto control these pests. 【Method】 Different concentrations of Cry1C were added to the surface of artificial diet of these three insects and bioassays were conducted in the laboratory. The control received no Cry1C artificial diet. Mortality was recorded at 1, 3, 5 and 7 d. 【Result】 The results showed that mortality ofA.caterpillarandP.lituraincreased gradually with increases in concentration and treatment time of Cry1C. At the 10 μg·mL-1Cry1C, mortalities ofA.caterpillarandP.liturawere 100% and 85.42%.A.caterpillarwas more sensitive to Cry1C thanP.litura. However,O.nubilalisandHelicoverpaarmigerawere not sensitive to Cry1C. 【Conclusion and significance】Cry1Cmay be a valuable candidate gene for controllingA.caterpillarandP.litura, but ineffective onO.nubilalisandH.armigera. This study provides a newBtgene type that can be used to control the different insect pests on the cotton plant.

Key words:Cry1C protein;Asparaguscaterpillar;Prodenialitura;Ostrinianubilalis;Helicoverpaarmigera

收稿日期(Received)：2015-09-29接受日期(Accepted)： 2015-10-10

基金项目:国家棉花产业技术体系(CARS-18-13)

作者简介:吕丽敏， 女， 助理研究员。 研究方向: 棉花抗虫性分子调控机理。 E-mail: llm0372@126.com *通讯作者(Author for correspondence), E-mail: cuijinjie@126.com

DOI:10. 3969/j.issn.2095-1787.2016.02.012