食源性致病菌的纸芯片检测方法研究进展

邴欣，刘静静，张震，刘兆臣，华京君，*

（1.山东省产品质量检验研究院，山东济南250012；2.山东师范大学生命科学学院，山东济南250014）

食源性致病菌的纸芯片检测方法研究进展

邴欣1，刘静静2，张震2，刘兆臣2，华京君1，*

（1.山东省产品质量检验研究院，山东济南250012；2.山东师范大学生命科学学院，山东济南250014）

纸芯片检测方法是一种成本低、可回收且易操作的检测方法。近年来微流控纸芯片技术在临床诊断、环境监控以及食品安全分析等方面都有着广阔的应用。本文介绍了食源性致病菌的纸芯片检测方法，讨论了纸芯片技术的应用进展以及开发前景。

纸芯片；食源性致病菌；检测；应用进展

食源性致病菌是危害食品安全和人类健康的主要因素，其引起的食品安全问题一直受到公众的广泛关注。为有效监控食品安全，建立便携、快速、有效的检测技术十分必要。传统食源性致病菌的检测技术存在耗时长、效率低、设备复杂等问题。纸芯片技术作为一种新型的纸上分析技术平台，其具有高效、便携、制作简单、操作方便、耗样量少等优点，引起了广泛关注并在多个领域得到应用。纸芯片检测不但可以实现对样品中多组分目标物的定量检测，而且可以实现对食品、环境中多种污染物的快速分析。本文介绍了纸芯片技术的优点及食源性致病菌的纸芯片检测方法，讨论了纸芯片检测的发展前景。

1 食源性致病菌的种类和危害

通过食物传播疾病的细菌有很多种，常见的革兰阴性菌有沙门菌属、志贺菌属、大肠杆菌等，常见的革兰阳性菌有芽孢杆菌属、链球菌属、李斯特菌属等。大多数肠道菌属于革兰氏阴性菌。

沙门氏菌是引起人类肠道疾病的主要食源性致病菌[1]。许多人感染沙门氏菌主要是食用了受污染的猪肉和猪肉产品[2]，它主要污染肉、蛋、奶等畜产品，能够引起肠伤寒、肠胃炎以及败血症等疾病，重者甚至危及生命。

志贺菌属是导致发展中国家和医疗卫生条件较差的地区幼儿腹泻疾病爆发的主要食源性致病菌之一，通过入侵和破坏结肠上皮细胞引发急性炎症[3]。由受到志贺氏菌污染的食品和水源引起的腹泻、痢疾等疾病的报道时有发生，超过一半的病例为5岁以下的儿童[4]。

大肠杆菌又称大肠埃希氏菌（Escherichia coli），其中有少数血清型可引起食源性疾病，对人类生命健康产生很大危害[5]。产肠毒素大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichiacoli，ETEC）可以导致人类和初生幼畜腹泻[6]，致病性大肠杆菌通过污染饮水、食品引起疾病，部分患者会发展为溶血性尿毒综合征，发生率最高的的年龄阶段为5岁～9岁[7]，病情严重者可危急生命。

2 食源性致病菌的检测方法

食源性致病菌快速检测方法主要有酶联免疫吸附分析法、免疫层析技术、ATP发光检测方法、传感器检测技术、PCR技术等[8-9]。

2.1 酶联免疫吸附分析法

酶联免疫吸附分析法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是将抗原抗体反应的高度特异性和酶的高效催化作用相结合发展建立的一种免疫分析方法[10]。是将特异性的抗体（抗原）包被在固体基质上，加入待测样品和酶标抗原（抗体），洗涤除去未结合物质，加入与酶反应的底物，底物经过酶的催化后呈现不同深浅的颜色，肉眼观察颜色深浅对待测样品进行定性测定。待测物的量与有色产物的量成正比，可借吸光度值进行定量检测[11]。

各种研究表明，ELISA对仪器设备要求不高，测定成本低，方法快速、简便，试剂保存时间较长，自动化程度高，无放射性同位素污染[12]。但该方法依然存在着诸多不足：无法进行多残留分析，对试剂的选择性高，对结构类似的化合物有一定程度的交叉反应，结果易出现假阳性等[13]。

2.2 免疫层析技术

免疫层析法（immunochromatography）是以硝酸纤维素膜为固相载体，通过毛细管作用使含金标记的抗原或抗体与特异性配体的反应在膜上进行，通过可目测的标记物而得到呈色的阳性信号，而游离标记物通过层析作用越过检带，与结合标记物自动分离[14]。随着免疫层析法的不断发展，标记材料和检测仪器多样化，检测结果从肉眼判定的半定量检测到现在仪器直接读数的定量测，灵敏度大大提高[15]。免疫层析技术具有简便、快速等特点，但依然存在着诸多不足：结果判定易受环境、观察时间等因素影响；检测存在交叉反应；易出现假阳性和假阴性反应，成本较高，多数产品不能定量等[16]。

2.3 ATP发光检测方法

细菌中的ATP含量与细菌数呈正相关，可通过生物荧光法检测细菌中ATP含量，间接获得细菌总数。研制了一种便携式生物荧光传感器，可依次进行细菌ATP的提取和检测，最终实现对细菌总数的快速检测。ATP发光检测技术具有快速经济、操作简单、易携带等特点[17]。但仍然存在诸多问题：检测过程需要将荧光信号转换为电信号，转换过程受外界环境影响；不具有特异性；灵敏度有待提高等[18]。

2.4 生物传感器检测技术

生物传感器是利用生物识别元件的特异性生化反应，借助各种信号转换元件对生化物质进行检测的一类装置，根据其感受器和换能器的不同分为多种生物传感器[19]。与传统检测方法相比，具有选择性强、精确度高、检测时间短等优势[20]，但仍然需要解决一些问题，如捕获效率低、电极稳定性差、重复性差等[21]。

传统方法检测食源性致病菌用量多、耗时长、检测设备复杂，多数方法只能对一种致病菌进行定性检测，因此，微流控纸芯片技术作为一种高效、耗样量少、便携、制作简单、操作方便的检测方法引起广泛关注。

3 微流控纸芯片的原理、优势、应用范围

微流控芯片技术（Microfluidic chip）是将生物或化学样品制备、输送、反应、分离、检测等基本操作集成到一块芯片上完成[22-23]。微流控芯片制作的材料一般采用硅片、玻璃、石英及多种有机聚合物材料，芯片的加工技术有光刻法、蚀刻法、热压法、模塑法等。其中光刻工艺是最基础的，并已被广泛应用于制作微流控装置。但是，此过程费时费力且成本较高[24]。

纸芯片是近几年发展起来的一种基于纸的微流控器件，它具有成本低廉、操作简单、不需要外援设备、可多元检测等优点，因而有望成为最廉价的分析检测器件[25]。同时，纸具有绿色环保，可回收，可降解等性质，对于大多数设备只需0.1 μL～1 μL待测样品足以饱和用于检测。这种平台有很大的潜力，提供接近“零成本”诊断[26]。纸通常是白色的，可以作为色度测试一个很好的媒介[27]。待测溶液在μPADs上可通过毛细管作用移动，无需外力，通过化学改性的μPADs表面可以对待测物进行简单快速的比色分析，也可与其它装置结合进行定量检测。

由于硝酸纤维素膜的平均孔径非常小且均匀制作过程中的蜡渗透慢得多，并且可以更精确地控制[28]。光刻需要六步而蜡印刷只需要两个步骤，当纸被加热时，蜡熔化并垂直和横向扩散进纸，创造了疏水性屏障。因此，固体蜡打印通道是目前最适合批量生产的[29]。

二维微流控纸芯片是基于亲水的通道和疏水的屏障的制作而成，在此基础上，利用多层滤纸的叠加或折叠等[30]方法制作三维微流控纸芯片。晶体管、发光二极管、基于纸的电池、超级电容器等都是基于纸的装置[31]。

基于这些优势，纸芯片设备被广泛应用于资源有限的环境中，例如紧急情况下、军事领域的任务、家庭医疗保健等[32]。微流控纸芯片技术被广泛应用到临床诊断、环境监控以及食品安全分析等方面[33]。

人类食源性和水源性的疾病通常是摄入了被病原菌污染的食品或饮料。Eden Morales-Narváez等[34]提出了一种纸基侧流免疫测定病原体的装置，结合石墨烯氧化物可致荧光猝灭来检测大肠杆菌，该装置在标准缓冲液中的检测限可达10 CFU/mL，在瓶装水和牛奶中检测限为100 CFU/mL。这种低成本的一次性和易于使用的设备有很大应用价值。

环境中农药的污染已经引起越来越多的关注，时刻提醒我们环境监测的重要性。Shoumei Wang等[35]提出了基于纸的印迹聚合物作为受体的化学发光检测设备，利用间接竞争法测定2，4-二氯苯氧乙酸农药，该装置可以检测飞摩尔级浓度的2，4-二氯苯氧乙酸农药。

2009年H1N1流感严重影响发展中国家，传统的诊断方法不适合在资源有限的环境中使用，Natalia M.Rodriguez等[36]开发了一种基于纸芯片的快速检测方法，直接从临床病人的鼻咽中提取样品，经纯化、等温链扩增后直接用试纸条检测，45 min内便可完成，检测限可达106Copies/mL，效率是传统检测方法的10倍。

4 食源性致病菌的纸芯片检测

传统生物化学方法检测食源性致病菌费时费力而且只能用于一种细菌的检测。Feng Tian等[37]提出了一种基于聚乙二醇与功能化纳米多孔氧化铝膜的微流控纸芯片，可同时检测样品中的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，该传感器的最低检测限可达102CFU/mL。

Wen-Hsin Chang等[38]将聚合酶链反应、纳米金探针检测与微流控纸芯片平台相结合，不但实现了活细菌的快速检测，检测限在102CFU/mL，同时可以区分最低104CFU/mL之间的多种细菌。

W Leineweber等[39]提出一个基于功能化纤维素纸的3-D蜡印微流控装置检测细菌。利用互补链结合检测细菌RNA的存在，金纳米粒子聚集可见色度变化，将其与电子设备连接可定量检测细菌RNA的浓度。这种检测方法可以该装置可以检测飞摩尔级RNA浓度。

Yixian Wang等[40]提出了一种基于胶体金和改性的石墨烯纸装置快速检测大肠杆菌O157：H7，将金属纳米材料、石墨烯纸和生物识别分子相结合，电化学阻抗谱法检测大肠杆菌O157：H7。结果表明，该装置线性范围宽（1.5×102CFU/mL ～1.5×107CFU/mL），最低检出限为1.5×102CFU/mL，该装置的石墨烯纸具有高耐受力。

5 总结与展望

综上所述，微流控纸芯片检测装置作为一种新型的便携式器件，在过去几年中得到广泛的关注与发展，其在食源性致病菌的检测中取得初步的应用，展现出广阔的发展前景。

然而，微流控纸芯片用于食源性致病菌的检测尚处于初期阶段，还有很多问题亟待研究改善。今后的研究方向主要包括开发廉价的疏水材料；提高图案的精度，实现液体的有序操控；随着电子产品的日益发展，电子分析、远程网络与微流控相结合方面有很大发展空间。

相信通过不断的优化与研究，研制针对食源性致病菌具有富集、分离、检测多功能于一体的微流控纸芯片，实现其定量分析的设备很快会出现，并将在其它领域有着更深入的应用。

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Research Progress of Paper Chips Detection Method for Food-borne Pathogenic Bacteria

BING Xin1，LIU Jing-jing2，ZHANG Zhen2，LIU Zhao-chen2，HUA Jing-jun1，*
（1.Shandong Product Quality Inspection Research Institute，Jinan 250012，Shandong，China；2.College of Life Science，Shandong Normal University，Jinan 250014，Shandong，China）

Paper chips detection method is a testing way that has advantages of low lost，recycle and easy-tohandle.In recent years，microfluidic chip technology had been widely applied in clinical diagnosis，environmental monitoring and food security analysis.This paper introduced paper chips detection method for foodborne pathogenic bacteria and discuss its application process and development prospect.

paper chips；food-borne pathogenic bacteria；detection；application process

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.14.044

国家质量监督检验检疫总局科技计划项目（2014QK122）

邴欣（1977—），男（汉），高级工程师，博士，研究方向：产品质量安全。

*通信作者

2016-04-07