植物组织培养的常见污染及其防控技术

任目瑾，周建峰

(陕西省苗木繁育中心，陕西 眉县 722305)

植物组织培养的常见污染及其防控技术

任目瑾，周建峰

(陕西省苗木繁育中心，陕西 眉县 722305)

在分析植物组织培养污染分类、污染原因基础上，提出了外殖体选择、采集、预培养、清洗消毒等外植体污染防控措施，熏蒸消毒、紫外灯照射灭菌、设备器械消毒等环境污染防控措施，操作人员卫生、操作规程执行等操作污染防控措施。

植物；组织培养；污染；管理

植物组织培养是利用细胞的全能性通过无菌操作把植物体的外植体接种于人工配制的培养基上，在人工控制的环境条件下进行离体培养的一套技术和方法。随着科技的发展，这项技术已越来越多地应用于植物快繁、种质保存和遗传改良。植物组织培养是在无菌条件下进行的，尽管各个环节的操作有严格的要求，但是污染还是经常发生，甚至影响到实验的成败和规模化生产。污染的出现增加了成本，浪费了资源，延误了时间，影响了工作效率。因此，分析植物组织培养中的污染种类，提出相应防控措施，对这项技术的推广利用具有重要意义。

1 污染分类

污染是指在培养过程中由于外界真菌、细菌或培养材料的内生菌所侵染，而使培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。按污染种类分为细菌污染、真菌污染和病毒污染。

细菌是所有微生物中数量最多的一类，无孔不入，泥土里、水里、空气里都散布着细菌，或者与其他生物共生，形状各异，大小不一。细菌污染的特点是在培养基表面或材料表面出现黏液状物体、菌落或者是浑浊的水迹状，有时甚至出现泡沫发酵状，一般在接种1～2d即能发现，菌落小，表面呈乳脂状光泽，一般有臭味。细菌污染主要来源于接种材料及工具。细菌污染占52.13%[1]，通常有球菌和芽孢杆菌等[2]。

真菌喜欢温暖潮湿的环境。真菌污染的特点是菌斑呈绒毛状、絮状，界限不明显，伴有不同颜色的孢子，一般在接种3～10d后才能发现，菌落大，颜色多样，表面呈毛绒状，一般有霉味。真菌的污染主要来源于环境。真菌中通常有青霉菌、芽枝霉菌、黑曲菌和酵母菌等[2]。

病毒颗粒特别微小，所以病毒污染的概率比较小。病毒肉眼看不到，污染难于发现，用电子显微镜才能观察到。由于病毒一般潜伏在细胞内，对整个细胞培养不会致死。多数病毒来源于外植体本身。

2 污染原因

组织培养中的污染原因很多，主要有外植体污染，外植体消毒不过关，组织培养中的设备、仪器、工具消毒灭菌不彻底，接种环境和培养环境不清洁[3]，操作人员卫生习惯不良，不能对原瓶苗污染情况仔细辨认，培养材料携带内生菌；不能严格地执行消毒流程等等。

3 污染的防控措施

3.1 外植体的污染

3.1.1 外殖体的选择和采集 为减少外植体污染，要从外植体采集源头注意防控，不同环境下的外植体其带菌程度不同。分生组织生长快，细菌几乎来不及感染，因此挽救濒临的植物、需要脱毒的植物都采用分生组织进行组织培养，可大大较少污染。一般情况下外植体的采集时间选择在春季晴天的中午，尽可能选择温室内的植株或新生嫩芽。因为春季万物复苏，蕴藏了一冬的新芽开始萌发，比其它任何季节污染都少，晴天阳光可以杀死一部分细菌，下雨天湿度大，植株上残留水分多，污染几率大，温室内植物比露天植物带菌少，新生嫩芽比老芽裸露时间短，带菌少。另外采集前人手、工具、用具必须用75%的酒精进行消毒，以免产生污染。

3.1.2 外植体的预培养 如果室外栽培的材料污染太严重，可先将植物样本挖出，改为室内盆栽，种植到蛭石或珍珠岩中，按要求控制生长，可使用抗生素，不要施肥，浇水时水不能溅到叶片上，保持稍强光照(不灼烧叶片为宜)，湿度保持在50%～60%的环境，待抽出新芽，有条件的进行细菌病毒检测，没有细菌的可做为外植体。不便移栽的植株，可套塑料袋，待长出新枝条后，再行采样。也可将田间采集的枝条用水冲洗干净后插入无糖的液体培养液或自来水中使其发枝，以这种新抽的嫩枝作为外植体，可大大减少内源菌的污染。

有些植株可进行黄化处理，采集田间的枝条放在无菌条件下，进行暗培养，待抽出徒长的黄化枝条时取材，可减少污染。

3.1.3 外植体的清洗消毒 外植体表面消毒既要求将外植体表面的微生物彻底杀死，又要求尽可能少伤害外植体组织和表层细胞。外植体采回来后，先用自来水冲掉表面的灰尘和杂物，剪掉不要的枝、叶等组织，放入烧杯中用洗洁精水浸泡3min，再用水冲洗干净，流水下再冲洗30min。然后带进无菌操作台，用75%的酒精浸泡30s，无菌水冲洗一遍，再用次氯酸钠、次氯酸钙或0.1%的升汞浸泡10～30min(视植株品种、幼嫩程度而定)，无菌水再冲洗5遍。升汞的消毒效果是最好的。但应当记住， 消毒剂是对植物有毒害作用的。应正确选择消毒剂的种类、浓度和处理时间，尽量减轻对外植体的伤害。

3.2 环境的污染

3.2.1 熏蒸消毒 组织培养室在启动生产前，进行熏蒸处理，甲醛用量4～6ml·m-3,高锰酸钾3～6g·m-3配比液熏蒸。使用时，先关闭所有的门窗，分别量取好需要的甲醛和高锰酸钾，将甲醛溶液倒入装有高锰酸钾的容器中，立刻会有烟雾产生，操作人员应避开烟雾马上离开，熏蒸30min即可，将室内环境的真菌减少87%～100%[4]。以后每月一次熏蒸。

3.2.2 紫外灯照射灭菌 培养架保持整洁干净无杂物，污染物品和污染培养基应及时清理出培养室，培养室和接种室每天用次氯酸钠消毒液进行地面消毒，每次接种前要用75%的酒精喷洒室内，使灰尘落地，防止微笑尘粒飞扬，然后紫外灯照射30min[5]。

3.2.3 设备器械的消毒 每天使用的工具、用具提前进行灭菌处理，操作台每次使用前用紫外灯照射30min，然后用75%的酒精喷湿脱脂棉擦拭操作台内的各个面，每月更换操作台上的过滤网，保持操作台上干净整洁，不能堆放不需要的物品，长期未使用的操作台使用前要进行彻底清洗消毒，每月用培养皿放培养基检测操作台的洁净度和高压灭菌锅的灭菌效果。高压灭菌锅如果灭菌不彻底，培养基也会出现污染，除严格执行操作规程外应每月用测试带检测灭菌效果。接种用的刀、镊子、剪刀等一般采用干热灭菌法,使用前用酒精棉球擦拭,并在火焰上灼烧,然后冷却备用[6],玻璃器皿、工作服等用湿热灭菌法，用报纸或棉布包好，放入高压灭菌锅，等压力稳定在0.105MPa,温度为121℃的条件下,维持18～20min,时间,冷却后备用。

3.3 操作污染的管理

3.3.1 操作人员卫生 操作污染控制首先要从工作人员卫生入手。操作人员应养成常剪指甲、勤洗澡的卫生习惯，进入无菌区不能戴戒指，不能吃东西，不能喝水，不能听音乐，禁止吸烟，工作服里外要分开，里面的只能在实验室穿，更衣室保持整洁干净，每天用消毒水拖地消毒；工作服每周清洗消毒一次，夏季每三天清洗消毒一次，口罩、帽子要非常干净，一次性用品要及时更换；进入无菌室前要用肥皂洗手，换好实验室的衣服和鞋之后用消毒液对双手进行消毒，进入培养室再次用75%的酒精对双手进行消毒。

3.3.2 操作规程的执行 操作污染是组织培养环节中最普遍的污染，也是可以控制的污染，操作人员除养成良好地卫生习惯外，还要严格执行操作规程和消毒流程。

(1) 配制室

每一月重新配制母液和激素，培养基一般提前2天配制，化学药品4℃保存，定期检查pH计、天平、温度计等、不能使用过期及质量不好的药品，高压灭菌锅炉严格执行操作规程。

(2)培养室

温湿度和光照要控制在适宜的范围内，温度25±1℃，湿度40%，光照1 500～3 000Lux，按时记录温湿度，及时调整，如果湿度过高，可使用空调“除湿”功能，保持室内湿度适宜，也可减少真菌生长繁殖，湿度过低可采用加湿器进行加湿。不定时检查灯管，及时更换，保证光照强度。

(3)操作室

每天酒精喷洒后，紫外灯消毒30min，用消毒液对地面进行清理消毒，定期检测操作台的洁净度，工具、用具的摆放位置，工具的灭菌时间等。

(4)操作过程

每次使用前对操作台进行全面消毒，用75%的酒精把脱脂棉喷湿，然后按照从上到下，从里到外，从左到右的顺序把操作台的每个面擦拭一遍，可以重复擦但不能有遗漏的地方，严格执行操作规程，注意操作时的先后顺序，工具的使用方法，瓶口的朝向等等。

[1] 方丽,王连平,茹水江，等. 植物组培过程中污染微生物种类及其季节性的变化[J].浙江农业学报，2013，25(2)：284-287.

[2] 邓小梅.植物组织培养过程中污染现象的研究进展[J].江西林业科技,2004(6):33-36.

[3] 胡凯，张立军，白雪梅，等.植物组织培养污染原因分析及外植体的消毒[J].安徽农业科学,2007，35(3): 680-681.

[4] 汪一婷.工厂化组培苗的污染及控制研究[J].安徽农业科学,2005,33(12):2357-2358.

[5] 徐连峰.林木组织培养及工厂化育苗中污染的控制技术[J].防护林科技,2005,66(3):119-120.

[6] 杜雪玲,张振霞,余如刚,等.植物组织培养中的污染成因及其预防[J].草业科学,2005(1)：24-28.

Contamination Control measures in Plant Tissue Culture

RENMu-jin,ZHOUJian-feng

(Shaanxi Seedling Reproduction Center, Mei County, Shaanxi 722305)

Contaminationsintheprocessofplanttissueculturewereclassifiedbasedonsourcesandreasons.Explantsselection,collectionandsterilizationaswellascontaminationcontrolmeasureslikesteaming,ultravioletlampandequipmentsterilizationwerehighlighted.Relevantregulationsforworkersandoperationprocedurestopreventcontaminationwereanalyzedinlightofthecontaminationtypesandreasons.

Plant;tissueculture;contamination;control

2016-07-15 作者简介：任目瑾(1969-),女，本科，工程师，主要从事植物组织培养和温室花卉栽培。

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