欣怡胶囊对大鼠心肌缺血再灌注损伤后炎症及氧化应激的影响

胡满燕， 吴珍妮， 龙子江*， 周宜轩

（1.安徽中医药大学，安徽合肥230038；2.安徽中医药大学第一附属医院，安徽合肥230038）



欣怡胶囊对大鼠心肌缺血再灌注损伤后炎症及氧化应激的影响

胡满燕1， 吴珍妮1， 龙子江1*， 周宜轩2

（1.安徽中医药大学，安徽合肥230038；2.安徽中医药大学第一附属医院，安徽合肥230038）

摘要:目的 探讨欣怡胶囊对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用及可能机制。方法 健康雄性SD大鼠60只，随机分为假手术组，模型组，复方丹参滴丸组（30 mg/kg），欣怡胶囊高、中、低剂量组（8.4、4.2、2.1 g/kg）。采用结扎大鼠心脏冠状动脉左前降支的方法，建立心肌缺血再灌注模型，记录不同时间段心电图ST段的变化，分离血清，10％甲醛固定心脏。采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测各组大鼠血清中肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）活性、肌钙蛋白T（cTnT）、核因子-κB（NF-κB）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）的量及超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性，显微镜下观察受损心肌病理学的改变。结果 与模型组比较，欣怡胶囊组能够降低心肌缺血再灌注损伤大鼠心电图ST段的抬高（P＜0.05、P＜0.01），降低血清中CK-MB活性、cTnT、NF-κB、TNF-α含有量（P＜0.05、P＜0.01），升高血清中SOD、GSH-Px活性（P＜0.05、P＜0.01），改善大鼠心肌组织形态的变化。结论 欣怡胶囊对大鼠心肌缺血再灌注损伤具有保护作用，其作用机制可能与减轻炎症反应，改善血管内皮功能，提高氧自由基清除能力，减少脂质过氧化损伤有关。

关键词:欣怡胶囊；心肌缺血再灌注；炎症；氧化应激

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.037

缺血性心脏病是目前心血管疾病中发病率和死亡率较高的一种疾病，常见的为急性心肌梗死、冠心病心绞痛［1］。目前，随着血管再通术在临床的迅速推广，已成为治疗缺血性心脏病的重要手段。但是在恢复血流灌注的同时会出现心肌缺血再灌注损伤，成为临床上治疗缺血性心脏病一个重要难题［2］。近年来中药因其毒副作用少、疗效较稳定等优点而受到临床广泛重视，成为医学研究的重点。欣怡胶囊是安徽中医药大学第一附属医院周宜轩教授临床长期应用治疗冠心病心绞痛之气虚血瘀症的经验方，该方由丹参、红参、水蛭、麝香4味中药组成，具有活血化瘀、益气通络、宣痹止痛的功能，临床上已取得较好疗效，但其具体的作用机制尚未见文献报道。本研究依据欣怡胶囊的临床作用，结合已有的基础研究资料，建立大鼠心肌缺血再灌注模型，探讨索该药物对大鼠心肌缺血再灌注的保护作用及其作用机制，为欣怡胶囊的临床合理应用提供科学依据。

1 实验材料

1.1 动物 健康雄性SD大鼠，SPF级，体质量为（230± 20）g（安徽医科大学动物中心提供），动物许可证号: SCXX（皖）2005-001。

1.2 药物和试剂 药物:欣怡胶囊，由安徽济人药业股份有限公司提供，批号130501；复方丹参滴丸，购自天津天士力制药股份有限公司，批号131215。

试剂: CK-MB、cTnT、NF-κB、TNF-α、SOD、GSH-Px试剂盒，均购自南京建成科技有限公司，批号分别为30024、E-30062、E-30644、E-30633、E-30266、E-31036。

1.3 仪器 XD-7100型心电图仪（上海医用电子仪器厂）；HX-300动物呼吸机（成都泰盟科技有限公司）；GFM-600倒置荧光显微镜（上海光密仪器有限公司）；YBL-2生物组织包埋机（孝感亚光医用生物科技研究所）；YT-6生物组织烘烤机（孝感亚光医用生物科技研究所）；LEICA RM234石蜡切片机（德国莱卡公司）；JW3021HR型离心机（安徽嘉文仪器装备有限公司）。

2 实验方法

2.1 分组和给药 取SD大鼠60只，体质量（230±20）g，称重，标记，将其随机分为6组，每组10只，分别为假手术组（冠状动脉下穿线不结扎），模型组，欣怡胶囊高、中、低剂量组（取胶囊内容物，采用生理盐水配制成药液，按照成人日服剂量18.02 g折算成大鼠剂量，灌胃给药量分别为8.4、4.2、2.1 g/kg），复方丹参滴丸组（研碎，以生理盐水配制成药液，按成人日服剂量270 mg折算成大鼠剂量，给药量30 mg/kg）。各组大鼠连续灌胃给药7 d，每日1次，其中假手术组和模型组给予等容积生理盐水。

2.2 心肌缺血再灌注损伤模型建立 术前禁食12 h，末次给药30 min后，参考经典缺血再灌注模型进行合理改良［3-4］。取大鼠，以3.5％的水合氯醛（1 mL/100g）腹腔注射麻醉，左侧卧位，针形电极插入四肢皮下，连接心电图机，剪去胸前手术区毛，碘酒消毒，分层剪开皮肤、胸前肌肉及筋膜，于左侧第4肋间，用弯头钳钝性分离肋间肌长，轻微拉开肋骨，将心脏挤出胸腔。以冠状静脉主干为标志，在左心耳下缘2～3 cm处以5～0无损伤缝合针穿线，结扎冠状动脉前降支，造成心肌缺血，立即用止血钳夹紧胸腔，经口腔插入橡皮管连接的动物呼吸机给予人工机械呼吸（频率45～50次/min，潮气量1～2 m L/100 g，呼吸比5∶3），结扎30 min后松开止血钳，再次开胸，剪断结扎线，恢复血液灌注，使其再灌注120 min。假手术组按同法操作，但只穿线不结扎。分别在正常状态、缺血、再灌注不同时间段记录II导联心电图。

2.3 造模结果 实验过程中，由于出现心室颤动、气胸及胸腔大出血等现象，各组大鼠均有1～2只死亡，剩余的各组取8只进行相关指标检测。

3 检测指标

3.1 心电图 分别于冠状动脉结扎前、结扎后0.5 h和再灌注后0.5、1、2 h记录心电图。观察II导联ST段变化，用游标卡尺测量ST段高度并统计分析。

3.2 大鼠血清含有量的测定 再灌注120 min后，麻醉大鼠，腹主动脉取血5～10 mL，室温静置30 min，3 000 r/min，离心10 min，分离血清，于-20℃冷冻保存。采用ELISA方法依照试剂盒说明书测定大鼠血清中CK-MB活性，cTnT、NF-κB、TNF-α含有量，SOD、GSH-Px的活性。

3.2 病理组织切片观察 取血后，取出心脏放置10％甲醛溶液中固定1周，在心尖上约3 mm处纵向切取左室心肌，梯度乙醇脱水，常规石蜡包埋，切片，染色，透明，封片，光学显微镜下观察（×400）心肌病理变化。

4 统计分析

5 结果

5.1 欣怡胶囊对再灌注损伤(MIRI)大鼠心电图的影响

与假手术相比，模型组大鼠在心肌缺血0.5 h，再灌注0.5、1、2 h，其心电图ST明显抬高而假手术组ST段变化较小，说明造模较成功。与模型组比较，欣怡胶囊高、中、低剂量组和复方丹参滴丸组均可降低ST段抬高程度，存在显著性差异（P＜0.05或P＜0.01），见表1。

表1　欣怡胶囊对心肌缺血再灌注后大鼠心电图ST段的影响（mm）（±s，n=8）

表1　欣怡胶囊对心肌缺血再灌注后大鼠心电图ST段的影响（mm）（±s，n=8）

注:与假手术组比较，**P＜0.01，*P＜0.05；与模型组比较，△△P＜0.01，△P＜0.05

组别　　正常　　缺血0.5 h　　再灌注0.5 h　　再灌注1 h　　再灌注2 h假手术组　0.096±0.016　0.117±0.0142　0.119±0.021　0.116±0.0255　0.113±0.013模型组　0.099±0.016　0.324±0.030**　0.296±0.028**　0.258±0.030**　0.221±0.046**欣怡胶囊高剂量组　0.101±0.016　0.222±0.052△△　0.188±0.022△△　0.166±0.062△　0.137±0.016欣怡胶囊中剂量组　0.100±0.010　0.272±0.031△△　0.222±0.009△　0.191±0.008△　0.132±0.009欣怡胶囊低剂量组　0.094±0.010　0.284±0.020△△　0.247±0.037△　0.196±0.040△　0.153±0.039复方丹参滴丸组　0.930±0.240　0.217±0.011△△　0.189±0.012△△　0.149±0.090△△　0.124±0.046△

5.2 欣怡胶囊对MIRI大鼠血清CK-MB活性、cTnT含有量的影响 与假手术组比较，模型组大鼠血清中CK-MB活性、cTnT含有量明显升高；与模型组比较，欣怡胶囊高、中、低剂量组和复方丹参滴丸组均能降低血清中CK-MB、cTnT的量，存在显著性差异（P＜0.05或P＜0.01），见表2。

表2　欣怡胶囊对MI R I大鼠血清CK-MB活性、c T n T含有量影响（±s，n=8）

表2　欣怡胶囊对MI R I大鼠血清CK-MB活性、c T n T含有量影响（±s，n=8）

注:与假手术组比较，**P＜0.01，*P＜0.05；与模型组比较，△△P＜0.01，△P＜0.05

组别　　剂量/ （g·kg-1）CK-MB/ （U·L-1）cTnT/ （ng·L-1）假手术组　-　 34.33±3.31　 14.04±1.16模型组　-　 45.39±4.58**　17.70±0.78**欣怡胶囊高剂量组　8.4　 38.14±1.97△△14.89±0.78△△欣怡胶囊中剂量组　4.2　 39.44±5.12△　15.83±1.54△△欣怡胶囊低剂量组　2.1　 41.00±1.75△　16.41±1.26△复方丹参滴丸组　3×10-239.27±1.41△△15.92±0.41△△

5.3 欣怡胶囊对MIRI大鼠血清NF-κB、TNF-α含有量的影响 与假手术组比较，模型组大鼠血清血清中NF-κB、TNF-α含有量明显升高；与模型组比较，欣怡胶囊高、中剂量组和复方丹参滴丸组均能降低血清中NF-κB、TNF-α含有量，存在显著性差异（P＜0.05或P＜0.01），见表3。

表3　欣怡胶囊对MI R I大鼠血清NF-κB、TNF-α含有量影响（±s，n=8）

表3　欣怡胶囊对MI R I大鼠血清NF-κB、TNF-α含有量影响（±s，n=8）

注:与假手术组比较，**P＜0.01，*P＜0.05；与模型组比较，△△P＜0.01，△P＜0.05

组别　　剂量/ （g·kg-1）NF-kB/ （ng·L-1）TNF-α/ （ng·L-1）假手术组　-　 354.35±22.55　 121.73±6.10模型组　-　 424.97±51.26**161.59±27.33**欣怡胶囊高剂量组　8.4　 362.85±22.58△△132.98±17.97△△欣怡胶囊中剂量组　4.2　 381.44±13.83△△136.64±8.32△欣怡胶囊低剂量组　2.1　 392.80±26.71　 145.76±18.39复方丹参滴丸组　3×10-2368.76±25.49△　128.13±11.56△△

5.4 欣怡胶囊对MIRI大鼠血清SOD、GSH-Px活性的影响与假手术组比较，模型组大鼠血清血清中SOD、GSH-Px活性明显下降；与模型组比较，欣怡胶囊高、中、低剂量组和复方丹参滴丸组均能升高血清中SOD、GSH-Px含有量，存在显著性差异（P＜0.05或P＜0.01），见表4。

5.5 欣怡胶囊对MIRI大鼠心肌组织形态学的影响 光镜下观察可看出:假手术组（图1-a），心肌纤维排列整齐、致密，未见断裂，结构清晰，心肌细胞无肥大、萎缩现象，细胞核呈椭圆形，分布较均匀；模型组（图1-b），可见肌纤维断裂、紊乱，心肌细胞间隙增宽，出现萎缩现象，部分有出血现象，核固缩、破裂；欣怡胶囊高剂量组（图1-c）、中剂量组（图1-d）、低剂量组（图1-e）及复方丹参滴丸组（图1-f），可见肌纤维排列较整齐、较致密，未见明显断裂，心肌细胞排列相对有规则，无明显的肥大、水肿现象。

表4　欣怡胶囊对MI R I大鼠血清S 0 D、GSH-Px活性影响（±s，n=8）

表4　欣怡胶囊对MI R I大鼠血清S 0 D、GSH-Px活性影响（±s，n=8）

注:与假手术组比较，**P＜0.01，*P＜0.05；与模型组比较，△△P＜0.01，△P＜0.05

组别　　剂量/ （g·kg-1）SOD/ （IU·L-1）GSH-Px/ （Pmo1·mL-1）假手术组　-　 75.34±16.52　 18.32±1.40模型组　-　 52.22±5.02**　14.33±0.80**欣怡胶囊高剂量组　8.4　 66.69±2.37△△15.95±0.94△△欣怡胶囊中剂量组　4.2　 65.53±10.57△△16.40±1.61△△欣怡胶囊低剂量组　2.1　 62.17±5.58△△15.76±1.24△复方丹参滴丸组　3×10-269.99±6.47△△16.72±0.86△△

图1　欣怡胶囊对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌组织形态学的影响（×400）

6 讨论

心肌缺血再灌注损伤（MIRI），往往会引发一系列病理性改变，表现为心肌收缩功能障碍、代谢紊乱，出现心肌细胞超微结构改变、无复流现象等。其发生机制可能与中性粒细胞浸润、氧自由基大量产生、Ca2 +超载、细胞凋亡等机制有关［5］。目前，中药凭借其多靶点、多层次的作用及中医治疗的辩证论疗、整体观念等特点，使得在治疗心肌缺血再灌注损伤方面有着独特的优势。欣怡胶囊该方以丹参为君药、红参为臣药、配伍水蛭、麝香。丹参主要含有丹参酮I活性成分，通过“养血”的作用达到活血化瘀的作用，有效改善血液流变，对抗血栓形成；红参主要有效成分为人参皂苷Rg、Rb，配合丹参活血化瘀，增强益气活血，养血安神作用；水蛭含水蛭素活性成分，能直接作用于凝血酶，具有较强抗凝、抗血栓、抗氧化作用，利于君臣之药活血化瘀作用；麝香性辛、温，具有活血通经、消肿止痛的功效，具有抗血栓、抗炎、抗肿瘤等作用。基于该复方的多成分、多层次、多靶点作用特点，进一步探讨欣怡胶囊对缺血再灌注损伤的保护作用及其作用机制。

心肌缺血时，心电图ST抬高程度与心肌缺血程度密切相关。本实验模型组大鼠在缺血30 min时，其心电图ST段较假手术组具有显著性抬高，欣怡胶囊各剂量组明显改善损伤大鼠ST段的抬高，减少心律失常的发生次数。但是单纯的心电图检查往往存在着特异性低和误诊的可能，因此，如何对心肌梗死进行准确的诊断已成为临床上探讨的重要问题［6］。目前，血清心肌酶谱和肌钙蛋白联合检查，在临床上诊断心肌梗死具有重要的应用价值［7-8］。正常情况下，CK-MB在心肌、肝脏、肾脏中含有量较高且血清中的含有量极少［9］，当心肌梗死或肝肾脏出现损伤时，大量组织细胞发生坏死或凋亡，血清中CK-MB活性显著升高，但使得心肌酶在判断心肌梗死方面缺乏特异性。肌钙蛋白T （cTnT）是肌钙蛋白复合物中的一种阻滞蛋白，仅存在于心肌组织中。正常状态下，心肌中cTnT含有量丰富且血清中几乎检查不到［10］。当心肌缺血、缺氧时，大量心肌细胞发生坏死或凋亡，血液cTnT水平显著升高，避免了心肌酶检查中其他疾病对诊断的影响。实验结果表明，模型组大鼠血清中CK-MB活性和cTnT含有量显著升高，欣怡胶囊各剂量组可以有效的降低血清中CK-MB活性和cTnT含有量，提示欣怡胶囊可以通过降低心肌损伤而发挥保护心肌作用。显微镜下观察发现欣怡胶囊各剂量组可明显改善心肌组织形态变化，进一步说明了欣怡胶囊能够缩小病变范围，减轻心肌细胞坏死程度，从而改善心肌功能。

研究发现，炎症与氧化应激在心肌缺血再灌注损伤过程发挥着重要的作用［11-12］，且炎症反应过程中往往伴随着脂质过氧化反应［13-14］。心肌缺血、缺氧时，受炎症刺激物作用引起内皮细胞受损、中性粒细胞激活而不断浸润于心肌细胞，引起微循环障碍、活性氧类增加，诱导大量氧自由基产生，包括超氧阴离子等大量不饱和脂肪酸而发生脂质过氧化反应，进一步损伤细胞膜、细胞器导致细胞坏死、凋亡，使得氧化和炎症间的连锁反应进一步加强。体内NF-κB是一种核转录因子，可调节许多蛋白基因的表达，白细胞介素、肿瘤坏死因子-α等基因的启动子上都有几个NF-κB结合点，当机体受到缺血、缺氧等刺激时，NF-κB会被激活，活化的NF-κB能够调控TNF-α的表达，进一步刺激内皮细胞、中性粒细胞等黏附因子的表达，最终浸润和损伤缺血心肌组织，导致心肌细胞损伤［15-16］。从实验结果中分析，模型组大鼠血清中炎症因子NF-κB、TNF-α含有量显著上升，而血清中抗氧化酶SOD、GSH-Px活性显著降低，说明体内活性氧的生成与清除的平衡被打破，诱导心肌细胞的脂质过氧化损伤。欣怡胶囊各剂量组尤其是高、中剂量组可有效的降低血清中炎症因子NF-κB、TNF-α含有量，升高血清中抗氧化酶SOD、GSH-Px活性。说明欣怡胶囊各剂量组可以通过减少炎症因子的释放，降低中性粒细胞浸润，改善内皮细胞功能，进一步减轻大量氧自由基产生，增强机体的抗氧化能力，减轻脂质过氧化损伤，使得机体形成一个良性循环，实现对心肌缺血再灌注损伤的保护作用。

综上所述，欣怡胶囊对心肌缺血再灌注损伤的大鼠有一定的保护作用，其作用机制可能与该复方能够减轻炎症反应，改善血管内皮功能，进一步提高氧自由基清除能力，减少脂质过氧化损伤、改善细胞膜的生物功能有关。

参考文献:

［1］ Ta1kie T，Yasuda S，Takahashi J，et al.Trends in acutemyocardia1 infarction incidence and morta1ity study［J］.Circ J，2010，74（1）: 93-100.

［2］ Ferdinandy P，Schu1z R，Baxrter G F，et al.Interaction of cardiovascu1ar risk factors with myocardia1 ischemia-rePerfusion injury［J］.Pharmacol Rev，2007，59（17）: 418-458.

［3］ 张玮玮，郭永清.大鼠急性心肌缺血再灌注模型的改进［J］.山西医药杂志，2009，38（10）: 902.

［4］ 刘家稳，刘新义，李健和，等.益心舒胶囊对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作［J］.中国中医药杂志，2013，38 （12）: 2005.

［5］ Jahanbakhsh Z，Rasou1ian B，Hermanova Z，et al.Protective effect of crocin against rePerfusion-induced cardiac arrhythmias in anaesthetized rats［J］.EXCLIJ，2012，11（12），11: 9-20.

［6］ 项贵明，刘琳琳，杜春兰，等.快速检测心肌标志物诊断急性心肌梗死的价值［J］.国际检验医学杂志，2011，32 （17）: 1932-1933.

［7］ Cordwe11S J，Edwards A V.Re1ease of tissue-sPecific Proteins into coronary Perfusate as a mode1 for biomarker discovery in myocardia1 ischemia-rePerfusion injury［J］.J Proteme Res， 2012，11（12）: 2014-2126.

［8］ 胡春丽.血清cTnI、MYO、CK-MB联合检测在急性心肌梗死诊断中的应用［J］.临床医学，2014，34（3）: 38-39.

［9］ Goya1S N，Arora S，Sharma A K，et al.Preventive effect of crocin of Crocus sativus on hemodynamic，biochemica1，histoPatho1ogica1and u1trastuctura1 a1terations in isoProtereno1-induced cardiotoxicity in rats［J］.Phytomedicine，2010，17 （11）: 227-32.

［10］ 王 阳，赵 媛.肌钙蛋白与肌红蛋白联合检查对心肌梗死的诊断价值［J］.中国医学检验杂志，2010，11（3）: 156-157.

［11］ 唐丹丽，刘寨华，张华敏，等.血府逐瘀汤对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用［J］.中国中药杂志，2011，35 （22）: 3077-3078.

［12］ Rodrigo R，Liby M，Fe1iu F，etal.Oxidative stress-re1ated biomarkers in essentia1hyPertension and ischemia-rePerfusion myocardia1damage［J］.Dis Markers，2013，35（2）: 773-790.

［13］ Seimon A T，Obstfed A，Karrar K，et al.Combinatoria1Pattern recognition recePtor signa1ing a1ter the ba1ance of 1ife and death in macroPhages［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103 （2）: 19794-19799.

［14］ 攀鑫酶，曹文疆，邢建国，等.香青兰总黄酮对大鼠心肌缺血再灌注损伤保护作用的研究［J］.中成药，2013，35 （8）: 1625-1629.

［15］ Wang Q，Tang X N，YenariM A.The inf1ammatory resPonse in stroke［J］.Neuroimmunol，2007，184（12）: 53-68.

［16］ 卞 海，居 靖，龙子江，等.无患子皂苷对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用［J］.中成药，2013，35（6）: 1309-1310.

*通信作者:龙子江（1957—），男，教授，从事中药对心脑血管疾病防治作用的研究。Te1: 0551-5169216，E-mai1: 1zjy1s@163.com

作者简介:胡满燕（1990—），女，硕士生，从事中药对心脑血管疾病防治作用的研究。Te1: 13956018684，E-mai1: Swa11owhu0312@163.com

基金项目:安徽省研究生”千人计划“项目资助

收稿日期:2014-11-10

中图分类号:R285.5

文献标志码:B

文章编号:1001-1528（2016）02-0406-04