甘草中5种三萜皂苷的同时测定及主成分分析

方诗琦， 瞿其扬， 仲欢欢， 李存玉，2， 彭国平，2， 郑云枫，2*

（1.南京中医药大学药学院，江苏南京210023；2.江苏省中药资源产业化过程协同创新中心，江苏南京210023）



甘草中5种三萜皂苷的同时测定及主成分分析

方诗琦1， 瞿其扬1， 仲欢欢1， 李存玉1，2， 彭国平1，2， 郑云枫1，2*

（1.南京中医药大学药学院，江苏南京210023；2.江苏省中药资源产业化过程协同创新中心，江苏南京210023）

摘要:目的 建立HPLC法同时测定产于中国内蒙古、新疆、甘肃和乌兹别克斯坦的甘草中甘草皂苷M3、22β-乙酰甘草酸、甘草皂苷G2、甘草酸和乌拉尔甘草皂苷B的含有量。方法 甘草60％乙醇提取物的分析采用Hedera ODS-2色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；乙腈-0.2％甲酸水溶液为流动相，梯度洗脱；体积流量为1.0 mL/min；检测波长为254 nm；柱温为30℃。然后，主成分分析（PCA）法对11批甘草中的三萜皂苷类成分进行分类。结果 这5个成分均显示出良好的线性关系（r≥0.999 8），平均加样回收率为97.7％～100.5％。而且，甘草酸和乌拉尔甘草皂苷B对其质量有显著影响。另外，可将内蒙古、新疆、甘肃产区的乌拉尔甘草与乌兹别克斯坦产区进行区分，但不能明显表征这3个中国产区的差异。结论 该方法简便快速，稳定准确，可为甘草的鉴定和质量控制提供参考。

关键词:甘草；三萜皂苷；主成分分析；HPLC

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.023

KEY W 0RDS: 1icorice；triterPenoid saPonins；PrinciPa1 comPonent ana1ysis（PCA）；HPLC

甘草为豆科蝶形花亚科多年生草本植物，全国均有分布，主产于亚洲及欧洲。我国地处甘草资源中心地带，也是世界上甘草使用量及出口量最大的国家，以新疆、内蒙古和甘肃为主产地。其中，作为法定的药用甘草有乌拉尔甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、胀果甘草Glycyrrhiza inflata Bat.或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的干燥根和根茎［1］。

作为多品种来源的中药，甘草的质量评价一直受到国内外学者的关注［2-7］，但总体而言，其成分分析主要集中在黄酮类成分的定性或定量检测，对皂苷类成分的研究并不深入。有文献报道，甘草中除了甘草酸外，还含有一系列皂苷类活性成分［8-12］，它们在不同品种及产地的甘草中是否存在差异，对该植物的品质是否有影响，都是值得关注的问题。

本实验以5个皂苷类成分（甘草皂苷M3、22β-乙酰甘草酸、甘草皂苷G2、甘草酸、乌拉尔甘草皂苷B）为指标，建立HPLC法同时测定甘草中这5个成分，并对产自内蒙古、新疆、甘肃等地区的甘草进行主成分分析，为进一步完善其质量控制与品质评价提供依据，也将为该资源的综合利用提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Ag1ient 1100高效液相色谱仪，包括G1314A紫外可见检测器、G1314A二元泵、Agi1ent 1100色谱工作站（美国Agi1ent公司）；JCS-1000电子天平（凯丰集团有限公司）；BT125D分析天平（十万分之一，赛多利斯科学仪器北京有限公司）；粉碎机（瑞安市永历制药机械有限公司）；KH-250B超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）。

1.2 试药 甘草酸对照品（g1ycyrrhizin，纯度≥98％，批号MUST-13083101，北京恒元启天化工技术研究院、北京世纪奥科生物技术有限公司）；甘草皂苷M3（1icorice-saPonin M3）、22β-乙酰甘草酸（22β-acetoxy1-g1ycyrrhizin）、甘草皂苷G2（1icoricesaPonin G2）、乌拉尔甘草皂苷B（ura1saPonin B）对照品（自制，纯度均≥98％）；乙腈为色谱纯（批号4B2935，美国Roe公司）；甲酸为分析纯（批号12050210705，南京化学试剂有限公司）；甲醇为色谱纯（批号20140616103，山东禹王实业有限公司化工分公司）。

甘草药材为豆科植物乌拉尔甘草G.uralensis、光果甘草G.glabra和胀果甘草G.inflate的干燥根及根茎，经南京中医药大学严辉副教授鉴定，符合《中国药典》2010年版项下标准。不同产地甘草的来源见表1。

表1　样品来源Tab.1 0 rlglns of sam ples

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Hedera ODS-2（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱；乙腈（A）-0.2％甲酸水溶液（B）为流动相，梯度洗脱（0～5 min，28％～30％A；5～50 min，30％～40％A）；体积流量为1.0 mL/min；检测波长为254 nm；柱温为30℃；进样量10 μL。色谱图见图1。

1.甘草皂苷M32.22β-乙酰甘草酸 3.甘草皂苷G24.甘草酸 5.乌拉尔甘草皂苷B1.1icorice-saPonin M32.22β-acetoxy1-g1ycyrrhizin 3.1icoricesaPonin G24.g1ycyrrhizin 5.ura1saPonin B图1　对照品和样品的HP L C色谱图Flg.1 HPLC chromatograms of reference substances and samples

2.2 对照品溶液的制备 精密称取甘草皂苷M3、22β-乙酰甘草酸、甘草皂苷G2、甘草酸和乌拉尔甘草皂苷B对照品适量，加甲醇溶解，制成5种对照品溶液。取上述溶液适量，置于同一量瓶中，制得甘草混合对照品溶液。其中，甘草皂苷M30.110 7 mg/mL、22β-乙酰甘草酸0.140 4 mg/mL、甘草皂苷G20.115 3 mg/mL、甘草酸1.839 6 mg/mL、乌拉尔甘草皂苷B 0.378 0 mg/mL。

2.3 供试品溶液的制备 精密称取甘草药材粉末（过3号筛）0.50 g，置于50 mL具塞锥形瓶中，精密加入60％乙醇25 mL，称定质量，超声提取30 min，静置至室温，密塞，再称定质量，60％乙醇补足减失的质量，摇匀，静置，取上清液，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.4 含有量测定

2.4.1 对照品线性关系考察 取“2.2”项下混合对照品溶液适量，逐级稀释法稀释后配成系列对照品溶液，分别吸取10 μL注入液相色谱仪，进行测定，以峰面积为纵坐标（Y），对照品质量浓度（mg/L）为横坐标（X）绘制标准曲线，得各对照品回归方程及线性范围，结果见表2。由表可知，5种成分在各自线性范围内与其峰面积均呈良好的线性关系。

表2　5个三萜皂苷类成分的线性关系Tab.2 Llnear relatlonshlps of flve trlterpenold saponlns

2.4.2 精密度试验 精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液10 μL，连续进样6次，测定各对照品峰面积。结果，甘草皂苷M3、22β-乙酰甘草酸、甘草皂苷G2、甘草酸和乌拉尔甘草皂苷B的峰面积RSD分别为1.0％、0.96％、1.2％、0.63％和1.3％，表明仪器精密度较好。

2.4.3 重复性试验 按“2.3”项下方法制备供试品溶液6份，精密吸取10 μL，在“2.1”项条件下测定。结果，甘草皂苷M3、22β-乙酰甘草酸、甘草皂苷G2、甘草酸和乌拉尔甘草皂苷B的峰面积RSD分别为1.7％、1.9％、2.1％、1.0％和1.4％，表明该方法重复性较好。

2.4.4 稳定性试验 精密吸取“2.3”项下供试品溶液，分别于0、2、4、8、16 h进样10 μL测定。结果，甘草皂苷M3、22β-乙酰甘草酸、甘草皂苷G2、甘草酸和乌拉尔甘草皂苷B的峰面积RSD分别为1.4％、1.8％、1.5％、0.78％和0.96％，表明供试品溶液在16 h内稳定。

2.4.5 加样回收率试验 精密称取含有量已知的甘草药材粉末（样品1）0.25 g（甘草皂苷M3、22β-乙酰甘草酸、甘草皂苷G2、甘草酸和乌拉尔甘草皂苷B的含有量分别为0.93、1.86、2.64、55.47、8.94 mg/g），共6份，分别加入低、中、高3个质量浓度的对照品溶液适量（相当于药材中各对照品原质量分数的80％、100％、120％），每个质量浓度取2份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，测定并计算平均回收率，结果见表3。

表3　加样回收率试验结果（n=6）Tab.3 Results of recovery tests（n=6）

续表3　

2.4.6 样品测定 取11批不同品种及产地的甘草药材，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取10 μL，注入液相色谱仪测定，再按标准曲线分别计算不同地区甘草药材中各成分的含有量，结果见表4。

表4　5个三萜皂苷类成分的含有量（mg/g）Tab.4 Contents of flve trlterpenold saponlns（mg/g）

2.5 主成分分析 应用SPSS 16.0软件，将11批甘草药材中5种三萜皂苷类成分的峰面积与药材取样量之比（即单位质量药材峰面积）进行主成分分析，以特征值大于1者为提取标准，得到3个主成分，累积贡献率达到91.86％。其中，第一主成分的方差贡献率最大，为41.00％，包含的信息最多，第二主成分为29.66％，第三主成分为21.20％。由图2可知，样品能被明显分成两类，分界较明显，样品1～4（光果和胀果甘草）集中分布在左侧，而样品6～10（乌拉尔甘草）集中分布在右下侧，但样品5和11离群较远，可能与三萜皂苷类成分的含有量有关。

图2　主成分得分图Flg.2 Score plot of prlnclpal components

因子负荷能反映各变量与主成分的相关性，其大小可表明各变量的影响程度。表5提供了5个色谱峰对于分类贡献的信息，其中峰4、5在第一主成分中起决定性作用，显著影响样品的分类；峰2、3在第二主成分中有明显的正相负荷；峰1对第三主成分影响较大。

3 讨论

3.1 色谱条件的选择 考察了甲醇-0.2％甲酸水、乙腈-0.2％甲酸水、甲醇/乙腈（2∶1）-0.2％甲酸水等不同比例的流动相体系，发现甲醇-0.2％甲酸水系统分离度最好，各峰的保留时间适中。为保证各指标性成分得到良好分离，还对Hedera ODS-2 （4.6 mm×250 mm，5 μm）、Waters Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Thermo Scientific ODS-2（4.6 mm×250 mm，5 μm）等不同色谱柱进行研究，发现Hedera ODS-2色谱柱得到的各指标性成分峰形最好，分离效果最为理想。

表5　因子负荷矩阵Tab.5 Factor load lng matrlx

3.2 含有量测定分析与主成分分析 采用本实验建立的色谱方法，对11个不同来源的甘草药材进行了含有量测定。结果表明，同一品种不同产地或同一产地不同品种的5个指标性成分之间含有量差异很大，这可能与当地气候、地理位置等生态环境，或种苗等遗传因素相关［13］。其中，甘草皂苷M3受产地的影响最大，产自乌兹别克斯坦的样品3、11及甘肃的样品9、10均不含有该成分。因此，推测乌兹别克斯坦和甘肃产区可能不具备产生甘草皂苷M3的有利条件。

然后，将数据进行主成分分析，发现4个不同产地的甘草药材具有一定的相似性和差异性。样品1～4为光果甘草和胀果甘草，集中分布在图2的左侧，而样品6～10均为乌拉尔甘草，集中分布在右下侧，可推断光果甘草与胀果甘草在两个主成分上具有一定的相似性，而乌拉尔甘草与上述其他两种甘草具有差异性。此外，样品6～10产于我国新疆、内蒙古及甘肃，在图2的分布较集中，而样品11产自乌兹别克斯坦，离群较远，故可用于乌拉尔甘草的中国与乌兹别克斯坦道地产区的区分。由表4可知，5和11号产地样品与其他产地差异较大，可能是土壤环境、遗传因素对植物中三萜皂苷类成分的影响较大，使得5号样品中该类成分的含有量普遍偏低，而11号样品偏高，这与主成分分析结果一致。

根据《中国药典》2010年版，甘草以甘草酸为指标性成分，并规定了含有量范围。结合本实验数据发现，上述11个来源的甘草药材中甘草酸含有量几乎都明显高于药典规定（不得少于2％），说明现行药典在甘草酸含有量限定上存在偏低情况，未能真实反映出药材本身质量的优劣差异，故建议下版药典能对其含有量限定项进行相应修订，使之更能客观地反映药材的质量现状。另外，不同品种及产地的甘草药材中均含有22β-乙酰甘草酸、甘草酸、甘草皂苷G2，但三者含有量差别较大，结合因子负荷矩阵可知，甘草酸和乌拉尔甘草皂苷B的含有量对甘草质量影响显著，而且22β-乙酰甘草酸和甘草皂苷G2也可产生一定的影响，故可将22β-乙酰甘草酸和甘草皂苷G2作为质量控制的另一指标。

三萜皂苷为甘草药材中的主要活性成分，其种类虽单一，但含有量差异较大。本实验通过对其含有量进行测定，可为初步区分我国各道地产区及控制从乌兹别克斯坦等中亚地区进口的甘草药材质量提供参考价值。该方法简便可靠，但由于三萜皂苷类成分对照品匮乏，药材的来源不够丰富，指标性成分的选择不够完善，故未能全面考察甘草药材中三萜皂苷类成分的含有量。若采用一测多评法，实现以甘草酸为对照的多个成分进行同步测定，可为甘草中各有效成分含有量测定提供对比依据，为不同地区该植物的规范化种植、品种保护及质量控制奠定基础。

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Slmultaneous determ lnatlon and prlnclpal com ponent analysls of flve trlterpenold saponlns ln llcorlce

FANG Shi-qi1， QU Qi-yang1， ZHONG Huan-huan1， LICun-yu1，2， PENG Guo-Ping1，2，ZHENG Yun-feng1，2 *
（1.School of Pharmacy，Nanjing University of ChineseMedicine，Nanjing 210023，China；2.Jiangsu Provincial Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization，Nanjing 210023，China）

ABSTRACT:AIM To estab1ish an HPLCmethod for simu1taneous1y determining the contents of 1icorice-saPonin M3，22β-acetoxy1-g1ycyrrhizin，1icorice-saPonin G2，g1ycyrrhizin and ura1saPonin B in 1icorice from Inner Mongo-1ia，Xinjiang，Gansu（China）and Uzbekistan.METH0DS The ana1ysis of 1icorice 60％ ethano1ic extractwas Performed on a Hedera ODS-2 co1umn（4.6 mm×250 mm，5 μm）in a gradiente1ution manner，mobi1e Phasewas acetonitri1e-0.2％ formic acid aqueous so1ution，f1ow rate was 1.0 mL/min，detection wave1ength was set at 254 nm，and co1umn temPeraturewasmaintained at30℃.Then PrinciPa1comPonentana1ysis（PCA）was used for the c1assification of triterPenoid saPonins in e1even batches of 1icorice.RESULTS These five constituents showed good 1inear re1ationshiPs（r≥0.999 8），whose arerage recoverieswere 97.7％ -100.5％.In addition，g1ycyrrhizin and ura1saPonin B had significant inf1uences on the qua1ity of 1icorice.Moreover，G.uralensis from Inner Mongo-1ia，Xinjiang and Gansu were different from Uzbekistan，but no c1ear distinction was characterized among these three Chinese growing areas.C0NCLUSI0N Thismethod is simP1e，raPid，stab1e and accurate，which can be aPP1ied to the qua1ity contro1of 1icorice.

*通信作者:郑云枫（1979—），男，博士，副研究员，从事中药化学成分研究与开发工作。Te1:（025）86798186；E-mai1: zyunfeng88@126.com

作者简介:方诗琦（1991—），女，硕士，研究方向为中药成分分离与分析。Te1:（025）86798186，E-mai1: fangsq8866@163.com

基金项目:国家自然科学基金项目（81202881）；江苏省高校优势学科建设工程资助项目（ysxk-2013）；江苏省中药资源产业化过程协同创新中心课题（ZDXM-2-8）

收稿日期:2015-08-07

中图分类号:R284.1

文献标志码:A

文章编号:1001-1528（2016）02-0336-06