酒石酸泰乐菌素残留蛋白质检验方法的建立

孙丽美 张现峰 张兆峰 刘龙坦

（山东鲁抗生物制造有限公司，山东济宁 273517）

酒石酸泰乐菌素残留蛋白质检验方法的建立

孙丽美 张现峰 张兆峰 刘龙坦

（山东鲁抗生物制造有限公司，山东济宁 273517）

酒石酸泰乐菌素是我国目前常用的一种兽用大环内酯类抗生素[1]，亦称泰农、泰乐霉素，可由放线菌属弗氏链霉菌经发酵提取而得到，有泰乐菌素碱、磷酸盐和酒石酸盐3种形态。本文建立的酒石酸泰乐菌素残留蛋白质的检验方法适用于酒石酸泰乐菌素残留蛋白质的限度检测[9]。分析验证表明该方法准确、可靠，重复性好，可用于控制酒石酸泰乐菌素中残留蛋白质的检测。

酒石酸泰乐菌素；检验方法；分析

1 材料与方法

1.1 仪器

高效液相色谱仪（Ultimate3000，赛默飞世尔（戴安）中国有限公司）；电子天平

1.2 化学试剂

磷酸二氢钠（国药集团化学试剂有限公司提供，分析纯），磷酸氢二钠（天津市凯通化学试剂有限公司提供，分析纯），氯化钠（国药集团化学试剂有限公司提供，分析纯），BSA（上海伯奥生物科技有限公司提供，生化试剂）。乙腈，甲醇均为色谱纯，由天津市凯通化学试剂有限公司提供。

1.3 酒石酸泰乐菌素残留蛋白质检测方法

色谱柱：凝胶排阻柱（TSKgel G2000SWXL，5μm，7.8 mm ID×30 cm，Column No. A00126）；流速：1.0ml/min；检测波长：215nm；柱温：25℃；流动相：0.02M磷酸盐缓冲液（称取约0.59g磷酸二氢钠、5.8g磷酸氢二钠、9g氯化钠用水溶解并稀释至1000ml，混合均匀，用0.45μm的滤膜过滤），进样量：10μl。

2 结果与分析

2.1 系统适用性试验

取系统适用性标准品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结论：BSA峰与其他色谱峰分离度大于1.5，系统适用性试验符合要求。

2.2 专属性

分别取BSA溶液、供试品溶液及供试品溶液与BSA溶液的混合液（供试品溶液与BSA溶液以1：1的比例进行混合）进行专属性试验。结果表明，供试品溶液中无峰。结论：该方法的专属性符合要求。

2.3 线性

取标准溶液逐级稀释，得浓度不同的线性试验用系列标准溶液。以标准溶液的浓度为横坐标，以峰面积的平均值为纵坐标做标准曲线，得回归方程y=50.226x-1.5755，线性相关系数R2=0.9997，结果表明残留蛋白在20～140μg/ml 范围内线性关系良好。

2.4 检测限和定量限

取稀释后的各溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。得泰乐菌素中残留蛋白质的检测限（S/N=3）为2.5 μg/ml，定量限（S/N=10）为7.5μg/ml。

2.5 准确度与精密度

取供试品适量进行加标回收率试验，系统考察方法的准确度。分别进行80μg/ml、100μg/ml、120μg/ml添加浓度的回收率试验，每批次同一浓度做3个平行，取上述准确度试验用系列溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图及BSA峰的峰面积。平均回收率（n=9）为96.6%，RSD为1.34%。

2.6 供试品测定

利用以上建立的方法分别取上述供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，并记录供试品溶液中BSA的峰面积。

3 讨论与小结

3.1 液相色谱柱的选择

在选定的流动相系统下，采用不同品牌的凝胶排阻柱色谱柱进行测定，均获得良好的峰形与分离度，显示本方法耐用性好，故选择凝胶排阻柱色谱柱。

3.2 溶剂的确定

酒石酸泰乐菌素属于兽用大环内酯类抗生素，极性较弱，在流动相选择上比较了磷酸盐缓冲液/水，磷酸盐缓冲液/乙腈以及水/乙腈的色谱保留性能和灵敏度，结果发现磷酸盐缓冲液/水流动相体系残留蛋白峰型最好、灵敏度最高。进一步优化磷酸溶液浓度和流动相配比，使残留蛋白获得最佳峰型和保留时间，最终确定流动相为0.02M磷酸盐缓冲液/水，流速为1.0ml/min。

3.3 进样量的确定

分别取系统适用性标准品溶液进样25，20，15，10，5μl，结果主峰柱效分别为4984，5816，6017，15423，9187，故选择进样量为10μl。

4 结论

通过对建立的酒石酸泰乐菌素残留蛋白质的检测方法的验证，可知：该方法的系统适用性试验中BSA峰的保留时间的RSD为：0.1%；峰面积的RSD为：1.0%；BSA峰与酒石酸泰乐菌素的相应的峰的分离度为：8.3。系统适用性试验符合方法验证的要求。该方法对酒石酸泰乐菌素中的蛋白质的测定专属性良好，泰乐菌素自身获得的色谱峰对蛋白质的色谱峰没有影响。该方法的检测限为：2.5 μg/ml。

本研究探讨并建立了利用高效液相色谱法测定酒石酸泰乐菌素残留蛋白质的检验方法。结果表明该方法准确、可靠，重复性好，可适用于酒石酸泰乐菌素残留蛋白质的限度检测。

[1]张致平.微生物药物学[M].北京：化学工业出版社，2003.

[2]侯玉荣，袁耀佐，张玫，等.β-内酰胺类抗生素中高分子杂质的研究和检测方法进展[J].药学与临床研究，2012，20（3）：240-244．