HPLC法测定不同产地马先蒿属植物中的毛蕊花苷

曹馨元， 曹文龙， 陶 锐， 栾 飞， 李茂星*

（1.兰州大学药学院，甘肃兰州730000；2.兰州军区兰州总医院药剂科，全军高原环境损伤防治重点实验室，甘肃兰州730050；3.天祝县藏医药开发研究所，甘肃武威733299）



HPLC法测定不同产地马先蒿属植物中的毛蕊花苷

曹馨元1，2， 曹文龙3， 陶 锐1，2， 栾 飞2， 李茂星1，2*

（1.兰州大学药学院，甘肃兰州730000；2.兰州军区兰州总医院药剂科，全军高原环境损伤防治重点实验室，甘肃兰州730050；3.天祝县藏医药开发研究所，甘肃武威733299）

摘要：目的 建立HPLC法测定不同产地（甘肃、青海、四川）7种马先蒿属（Pedicularis L.）植物中毛蕊花苷的含有量。方法 马先蒿属植物75％甲醇提取液的分析采用Waters C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相甲醇-0.27％冰醋酸水溶液（35∶65）；检测波长330 nm；体积流量1 mL/min。结果 13个样本中毛蕊花苷含有量的差异较大。其中，甘肃省武威市天堂乡采集到的甘肃马先蒿（茎、根）、中国马先蒿、藓生马先蒿、俯垂马先蒿中毛蕊花苷的含有量分别为3.62％、0.27％、6.49％、2.17％、3.47％，天祝县采集到的中国马先蒿、藓生马先蒿中分别为1.81％、2.26％；青海省采集到的甘肃马先蒿、藓生马先蒿、白花甘肃马先蒿中分别为3.28％、2.01％、2.45％；四川省诺尔盖草原采集到的轮叶马先蒿、碎米蕨叶马先蒿、藓生马先蒿中分别为0.46％、1.22％、1.37％，RSD值均小于2％。结论 毛蕊花苷广泛存在于马先蒿属植物中，其中甘肃马先蒿地上部分中毛蕊花苷的含有量高于地下部分。

关键词：马先蒿属；毛蕊花苷；产地；HPLC

马先蒿是玄参科马先蒿属（Pedicularis L.）植物，关于其化学成分的研究表明［1-4］，该植物中含有环烯醚萜苷［5］、苯乙醇苷［6-8］、生物碱等多种化合物，具有滋阴补肾、补中益气、健脾和胃、清热解毒、利尿、保肝等作用。其中，毛蕊花苷（verbascoside）属于苯乙醇苷类化合物，主要存在于木兰科、菊科、蔷薇科、唇形科、玄参科等多种植物中，因其抗炎、抗菌、抗肿瘤、保肝、抗氧化、抗衰老、免疫调节、抗病毒、增强记忆等多种药理作用［9］，受到广大学者的关注。作为马先蒿属植物的主要活性成分，建立其有效的定性定量分析方法是很有必要的。马先蒿属植物资源丰富，来源相对廉价，故合理的开发利用不仅有利于相关医药产品的研发，也会在一定程度上促进当地经济的发展。有关毛蕊花苷含有量的测定方法已有较多文献报道［10-13］，本实验首次建立了HPLC法同时测定3种产地7种马先蒿属植物中该成分的含有量，该方法简单、快速、经济，能为其开发利用及品质评价提供参考，也可为其单体生物活性的进一步研究奠定基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Waters高效液相色谱仪，包括Waters 1525四元梯度泵、Waters-2998二极管阵列检测器、Waters-2707自动进样器、Waters-TCM柱温箱（美国Waters公司）；HP-8453紫外可见分光光度计（美国惠普公司）；BP210s电子分析天平（德国Sartorius公司）；SK7200H超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）。

1.2 材料 甲醇为色谱纯；水为注射用水；其他试剂均为分析纯。毛蕊花苷对照品（实验室自制，MS、NMR确定其结构，HPLC测定其纯度＞97.5％）。7种马先蒿药材于2014年8月采自甘肃、青海及四川，分别为甘肃马先蒿Pedicularis kansuensis、中国马先蒿P.chinensis、藓生马先蒿P.Muscicola、碎米蕨叶马先蒿P.cheilanthifolia、俯垂马先蒿P.cernua、轮叶马先蒿P.verticillata、白花甘肃马先蒿P.kansuensis Maxim subsp.kansuensis f.albiflora Li。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Waters C18色谱柱（4.6 mm× 150 mm，5 μm）；流动相为甲醇-0.27％冰醋酸水溶液（35∶65），梯度洗脱；体积流量1 mL/min；柱温25℃；进样量10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取毛蕊花苷对照品5.00 mg，置于10 mL量瓶中，10％甲醇溶解，定容至刻度，得标准品母液。再取母液适量，10％甲醇稀释至质量浓度为52 μg/mL，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 分别取7种马先蒿药材适量，粉碎（过四号筛），精密称取2 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入75％甲醇50 mL，称定质量，60℃回流提取30 min，冷却，再称定质量，75％甲醇补足减失质量，摇匀，滤过，取续滤液1 mL，稀释到10 mL量瓶中，即得。测定前，以0.45 μm微孔滤膜滤过。

2.3 测定方法 精密量取供试品和对照品溶液10 μL，注入HPLC色谱仪，记录色谱图，结果见图1。

2.4 线性关系考察 精密吸取对照品溶液100、300、500、900、1 100、1 300 μL，分别定容至5 mL，进样10 μL。以毛蕊花苷对照品溶液质量浓度（μg/mL）为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，得回归方程Y=7 075.8X+ 1 396.9，r=0.999 8。结果表明，毛蕊花苷在1.3～169 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度试验 取毛蕊花苷对照品溶液适量，在“2.1”项色谱条件下连续进样6次。结果，RSD为0.68％，表明仪器精密度良好。

2.5.2 稳定性试验 取同一供试品溶液，室温下分别于0、2、4、6、12、24 h进行测定。结果显示，各样品峰面积的RSD分别为2.0％、0.89％、1.3％、0.72％、1.8％、2.1％、0.89％、1.9％、1.5％、0.93％、0.40％、0.27％、1.4％，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.5.3 重复性试验 取各药材粉末适量，按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下测定。结果，各样品中毛蕊花苷的RSD分别为1.91％、3.35％、1.15％、1.85％、1.03％、1.76％、3.61％、2.22％、2.13％、1.17％、2.65％、1.72％、0.59％，表明该方法重复性良好。

2.5.4 加样回收率试验 精密称取含有量已知的甘肃马先蒿6份，每份0.75 g，加入16.9 mg/mL对照品溶液500 μL，按“2.2.2”项下方法制备样品溶液，在“2.1”项色谱条件下平行测定，记录色谱图，并计算加样回收率，结果见表1。

1.毛蕊花苷1.verbascoside图1　HPLC色谱图　Fig.1 HPLC chromatogram s

2.5.5 含有量测定 精密称取7种药材粉末3份，每份2 g，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下分析，结果见表2。

表1　加样回收试验结果Tab.1 Results of recovery tests（n=6）

表2　马先蒿样品中毛蕊花苷含有量（n=6）Tab.2 Content of verbascoside in Pedicularis L.samp les （n=6）

3 讨论

3.1 流动相的选择 毛蕊花苷是苯乙醇苷类化合物，具有多个酚羟基，在酸性条件下稳定性较好。本实验考察了不同比例的乙腈-水、甲醇-水系统作为流动相的效果，最终确定色谱条件为甲醇-0.27％冰醋酸水溶液=35∶65。

3.2 检测波长的选择 毛蕊花苷化学结构复杂，具有多个共轭双键，经紫外分光光度计全波长扫描，测得其最大吸收波长为330 nm，并以此作为检测波长。

3.3 样品制备 在供试品制备方法上，本实验考察了75％甲醇及水对毛蕊花苷提取效率的影响，发现以前者为提取溶剂时效率最高。在此基础上，又比较了热回流和超声对提取结果的影响，发现前者提取效率高。因此，确定以75％甲醇热回流提取30 min为供试品制备方法，既简便可靠，又不会造成有效成分的破坏。

3.4 资源利用 本实验采用HPLC法测定了7种不同马先蒿植物中毛蕊花苷的含有量，并以其为指标，考察了不同产地及品种马先蒿的品质差异。结果显示，7种马先蒿植物茎叶中均含有毛蕊花苷，但含有量有差异，甘肃马先蒿地上部分中毛蕊花苷的含有量高于地下部分，这为进一步保护资源、开发扩大用药部位及资源的可持续利用提供了科学依据。而且，不同地区海拔、气候等原因均可造成药材中目标成分含有量的差异，本实验比较了3个省份马先蒿中毛蕊花苷的含有量，可为药材品质评价及该成分生物活性的深入研究奠定基础。

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Determ ination of verbascoside in plants of Pedicularis L.from different grow ing areas by HPLC

CAO Xin-yuan1，2， CAOWen-1ong3， TAO Rui1，2， LUAN Fei2， LIMao-xing1，2*
（1.School of Pharmacy，Lanzhou University，Lanzhou 73OOOO，China；2.Departmentof Pharmacy，Lanzhou General Hospital of PLA；Key Laboratory of Prevention and Cure for Plateau Environment Damageof PLA，Lanzhou 73OO5O，China；3.Tianzhu County DevelopmentResearch Institute for Tibetan Medicine，Wuwei733299，China）

ABSTRACT：AIM To estab1ish an HPLCmethod for determining verbascoside in seven kinds of p1ants of Pedicularis L.from differentgrowing areas（Gansu，Qinghaiand Sichuan）.M ETHODS The ana1yses of p1ants of Pedicularis L.75％ methano1ic extractswere performed on Waters C18co1umn（4.6 mm×150 mm，5 μm），mobi1e phase was MeOH-0.27％ g1acia1acetic acid（35∶65），detection wave1ength was set at 330 nm，f1ow rate was 1 mL/min.RESULTS Therewere obvious differences in verbascoside content in thirteen samp1es.Among them，those in P.kansuensis（stems and roots），P.chinensis，P.muscicola and P.cernua in Tiantang（Wuwei，Gansu）were 3.62％，0.27％，6.49％，2.17％ and 3.47％，those in P.chinensis and P.muscicola in Tianzhu were 1.81％ and 2.26％，those in P.kansuensis，P.muscicola and P.kansuensis Maxim subsp.kansuensis f.albiflora Li（Qinghai）were 3.28％，2.01％ and 2.45％，and those in P.verticillata，P.cheilanthifolia and P.muscicola in Nouergai prairie（Sichuan）were 0.46％，1.22％ and 1.37％，respective1y.A11the RSDswere 1ess than 2％. CONCLUSION Verbascoside is wide1y distributed in p1ants of genus Pedicularis，whose content in the above-book=127,ebook=133ground part is higher than that in the under-ground part of P.Kansuensis.

KEY WORDS：Pedicularis L.；verbascoside；growing areas；HPLC

*通信作者：李茂星（1973—），男，博士，副主任药师，从事中药新药研究与开发。Te1：（0931）8994676，E-mai1：1imaox2005@ a1iyun.com

作者简介：曹馨元，硕士，从事天然药物化学、中药新药研究与开发。Te1：（0931）8994676，E-mai1：caoxy14@1zu.edu.cn

基金项目：国家自然科学基金面上项目（81374019）；甘肃省中医药管理局课题（GZK-2015-59）；全军医药卫生科研项目（CLZ15JA05）

收稿日期：2015-03-20

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.028

中图分类号：R284.1

文献标志码：A

文章编号：1001-1528（2016）01-0126-05