眼针八区八穴对脑缺血再灌注24 h大鼠海马组织中MAPK信号传导通路的影响*

张 威，马贤德，田维柱

(1．辽宁中医药大学附属医院，沈阳 110847;2．辽宁中医药大学，沈阳 110847)

眼针八区八穴对脑缺血再灌注24 h大鼠海马组织中MAPK信号传导通路的影响*

张 威1，马贤德2，田维柱△

(1．辽宁中医药大学附属医院，沈阳 110847;2．辽宁中医药大学，沈阳 110847)

目的:观察八区八穴取穴眼针疗法对脑缺血再灌注损伤模型大鼠海马组织中p38MAPK、ERK1/2、JNK表达水平的影响，探讨八区八穴取穴眼针疗法治疗缺血性脑病的部分机制。方法:健康SPF级雄性SD大鼠40只，体质量(280±20)g。按体质量随机分组，分为空白对照组(8只)、假手术组(8只)和模型复制组(24只)。对模型复制组24只大鼠采用线栓法进行模型复制，模型评价后，筛选模型合格的大鼠进行亚组划分，分别为模型对照组、眼针对照组，即分为正常组、假手术组、模型组、眼针组4组。眼针组大鼠给予眼针干预，再灌注即刻以及之后的每8 h进行1次针刺治疗，至再灌注24 h取材进行相关指标检测。采用免疫组织化学法检测各组大鼠海马组织中P38MAPK、ERK1/2和JNK蛋白表达水平。结果:与空白对照组比较，模型对照组和眼针组大鼠海马组织中P38MAPK、ERK1/2、JNK蛋白表达水平均显著升高;与模型对照组比较，眼针组大鼠脑组织中P38MAPK、ERK1/2、JNK蛋白表达水平显著下降。结论:眼针可能通过抑制p38-MAPK信号传导通路而发挥其脑保护作用。

八区八穴;脑缺血再灌注;眼针;p38MAPK;JNK;ERK．

脑中风病根据其病因不同分为缺血性中风和出血性中风。缺血性中风主要是因为脑血管的狭窄或堵塞而引发的1组以脑缺血、缺氧为主要症状的疾病。随着人们饮食结构的改变，缺血性脑病的发病率日益增高。另外，缺血性中风的高致死率、致残率等原因，使人们对该疾病的防治逐年受到重视。

眼针疗法是彭静山教授于20世纪70年代首创，应用临床治疗缺血性脑病几十年。后人在应用彭静山眼针疗法的同时，继续对该方法逐步进行改善，先后在针刺器具及选穴等方面进行了方案的优化。八区八穴取穴方法由田维柱教授提出，该方法取穴更简单，更易定位，克服了以往因眼周区域小而带来的取穴难以精确的缺点。临床疗效显示，八区八穴取穴方法与原八区十三穴取穴方法的疗效并无明显差异。

本研究拟采用八区八穴取穴方法对脑缺血再灌注模型大鼠进行眼针疗法干预，并对海马组织中P38MAPK、ERK1/2和JNK蛋白表达水平进行检测，观察各组间蛋白表达水平的差异，探讨八区八穴取穴法对脑缺血再灌注损伤的部分作用机制，为临床八区八穴取穴法的推广提供实验依据。

1 材料与试剂

1.1 实验动物

健康SPF级雄性SD大鼠40只，体质量(280± 20)g，由辽宁长生生物技术有限公司提供，实验用大鼠购自辽宁长生生物技术有限公司(动物许可证编号SCXK(辽)2010-0001)。大鼠购入后，于辽宁中医药大学实验动物中心SPF级实验动物室内适应性饲养1周，然后进行实验。实验期间，给予大鼠常规颗粒饲料喂养，隔日更换垫料，自由饮水，室温(20±2)℃，相对湿度45%。实验设计及实施过程中严格遵循动物实验的3R原则［1］。

1.2 设备及器材

1.2.1 仪器设备 37℃恒温水浴锅，常州国华仪器制造厂(SHA-B型)。

1.2.2 手术器材 手术器械、缝合针线及手术敷料由辽宁中医药大学实验动物中心手术室统一提供。钓鱼线购自渔具店，直径为0.25 mm，使用前裁剪成5 cm，一端用细砂纸打磨成半球形，用黑色油性记号笔在距离半球形端1 cm、1.8 cm、2.2 cm处做3个标记备用。

1.3 实验试剂

兔抗大鼠P38MAPK、ERK1/2、JNK抗体购自abcam公司，免疫组织化学SP试剂盒及DAB显色试剂盒均购自武汉博士德生物科技有限公司。

2 方法

2.1 实验分组

健康SPF级雄性SD大鼠40只，体质量(280± 20)g。按体质量随机分为空白对照组(8只)、假手术组(8只)和模型复制组(24只)。对模型复制组24只大鼠进行模型复制，模型评价后筛选模型合格的大鼠进行亚组划分(实际剩余18只)，分别为模型对照组(计划12只，实际9只)、眼针对照组(计划12只，实际9只)，即分为正常组、假手术组、模型组、眼针组4组。

2.2 模型复制

MCAO模型复制参照李玉芳等研究方法［2］，对模型复制组的24只大鼠采用改良线栓法复制脑缺血再灌注损伤大鼠模型。假手术组术式同模型复制组，但插入钓鱼线的深度仅为0.5～1 cm。空白组大鼠正常饲养，不做任何处理。

2.3 模型评价

再灌注完成后1 h，待大鼠完全苏醒后进行神经功能缺损评分。参照ZeaLonga 5分制评分标准［3］: 0分:无明显神经功能缺损症状;1分:大鼠不能完全伸展对侧的前爪;2分:大鼠向前爬行时向对侧转圈;3分:大鼠向前爬行的时候向对侧倾倒;4分:大鼠不能自发行走，意识丧失。被评为1～3分的大鼠均可纳入实验组，而0分或4分的大鼠因未达标予以排除。实验结束后，清点各组大鼠死亡情况，计算各组大鼠死亡率。

2.4 干预因素施加

空白对照组不施加任何干预因素，正常饲养至实验结束，取材进行指标检测。假手术组按照上述假手术模型复制方法进行假手术模型复制后，不施加任何其他干预因素，至再灌注24 h取材进行相关指标检测。模型对照组按照上述模型复制方法进行MCAO模型复制后，不施加任何其他干预因素，至再灌注24 h取材进行相关指标检测。眼针组按照上述模型复制方法进行MCAO模型复制后，再灌注即刻进行针刺治疗，之后每8 h进行1次针刺治疗，至再灌注24 h取材进行相关指标检测。

2.5 样本采集

各组大鼠于再灌注24 h后断髓处死，剥离完整大脑浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定，常温固定24 h后转至4℃冰箱中保存，用于免疫组织化学检测。

2.6 各组大鼠大脑海马组织中的P38MAPK、ERK1/2和JNK表达水平检测

采用免疫组织化学法检测各组大鼠海马组织中P38MAPK、ERK1/2和JNK表达水平。

将固定好的脑组织常规制备石蜡切片，脱蜡至水，经抗原修复及去除内源性过氧化酶后，采用SP法对切片中P38MAPK、ERK1/2和JNK的表达水平进行检测，分别经一抗(1∶300)、二抗(1∶500)孵育后DAB显色，数码显微镜下采集图像，采用BI-2000微循环和医学图像分析系统测定各组大鼠脑组织切片的平均光密度值，并进行统计分析。

3 统计学方法

采用SPSS 11.5统计软件进行统计分析，实验数据以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

4 结果

4.1 各组大鼠神经功能缺损评分

表1显示，各组大鼠神经功能缺损评分结果，模型复制组大鼠神经功能缺损评分显著高于空白对照组和假手术组(P＜0.01)，而空白对照组和假手术组间比较差异无统计学意义。

表1 各组大鼠神经功能缺损评分(±s)

表1 各组大鼠神经功能缺损评分(±s)

注:*P＜0.01 vs control group;#P＜0.01 vs sham operation group

组别 鼠数neurological deficit scores Control 8 0.000±0.000 sham operation 8 0.125±0.354 model 18 2.333±0.594*#

4.2 各组大鼠海马组织中P38MAPK、ERK1/2和JNK蛋白表达水平检测

表2、图 1～4显示，各组大鼠海马组织中P38MAPK、ERK1/2和JNK蛋白表达水平结果与空白对照组比较，模型对照组和眼针组大鼠脑组织中P38MAPK、JNK蛋白表达水平均显著升高(P＜ 0.01);与模型对照组比较，眼针组大鼠脑组织中P38MAPK、JNK蛋白表达水平显著下降(P＜0.05)。

表2 各组大鼠海马组织中p38MAPK、ERK1/2、JNK表达水平比较(±s)

表2 各组大鼠海马组织中p38MAPK、ERK1/2、JNK表达水平比较(±s)

注:与空白对照组比较:*P＜0.01;与模型对照组比较:#P＜0.05

组别 鼠数p38MAPK ERK1 ERK2 JNK空 白 对 照 组 6 0.164±0.022 0.161±0.023 0.153±0.016 0.154±0.013假 手 术 组 6 0.153±0.026 0.156±0.034 0.154±0.028 0.157±0.03模 型 对 照 组 6 0.494±0.037* 0.507±0.047* 0.529±0.041* 0.512±0.038*眼 针 组 6 0.404±0.03*# 0.598±0.062*# 0.573±0.027*# 0.401±0.031*#

图1 各组大鼠海马组织中p38MAPK表达

图2 各组大鼠海马组织中ERK1表达

图3 各组大鼠海马组织中ERK2表达

图4 各组大鼠海马组织中JNK表达

5 讨论

5.1 八区八穴取穴法

眼针疗法由彭静山教授首创，并根据人体眼周穴位分布，将眼周分为八区十三穴。田维柱是彭静山的高徒，多年来对眼针疗法有改进、充实、发扬和提高。为提高“眼针疗法”临床疗效，近20余年田维柱经过不断学习、理解、实践改进并简化了眼针分区，将原有的“八区十三穴”合并为“八区八穴”。多年的临床应用证明，田维柱眼针分区定穴的有效性和科学性，简化眼针分区定穴提高了临床疗效，完善并发扬了眼针技术。

5.2 MAPK信号传导通路与脑缺血再灌注损伤

研究表明，在线粒体内蛋白激酶包括p38MAPK、JNK、ERK1/2以及Raf-l、Src、Fyn、PKA、PKB/Akt、PKC这些蛋白激酶都在细胞分化和细胞调亡中扮演着重要角色，它们可使细胞调亡前引导蛋白或抗调亡蛋白(Bad，Bax，Bcl-xL)发生磷酸化，从而导致电位或信号的传导。诸多实验证实了这些蛋白激酶在线粒体膜内外移动或存在于在体或离体细胞线粒体的胞浆中［4-7］，提示这些蛋白激酶在线粒体中进行迁移，从而在脑缺血再灌注损伤中起重要作用。

结果显示，与空白对照组和假手术组比较，模型对照组大鼠海马和脑皮质区内的p38MAPK、JNK、ERK1/2表达水平显著升高，提示在脑缺血再灌注发生的过程中，p38MAPK、JNK、ERK1/2表达上调，从而激活p38MAPK信号传导通路造成脑损伤，该研究结果与以往研究结果一致［8-11］。而眼针干预后，p38MAPK、JNK表达水平得到显著抑制，而ERK1/2表达水平提高，提示我们眼针可能通过抑制p38MAPK及JNK的表达，促进ERK1/2信号传导通路的激活而实现其脑保护作用。

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［11］王巍．大鼠慢性脑缺血后海马HCN1及p38MAPK的表达［D］．长春:吉林大学，2013．

The Effects of MAPK Signal Transduction Pathway in Rat Hippocampus Pattern of Ischemia Reperfusion in 24h by Eye Acupuncture's Eight Districts 8 Points

ZHANG Wei1，Ma Xian-de2，Tian Wei-zhu△
(1．Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110847，China; 2．Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110847，China)

To observe the influence of the P38MAPK，JNK，ERK1/2 protein expression in rats hippocampus cerebral ischemia reperfusion and to explore its mechanism．Methods:40 male SD rats were randomly divided into control group(8 rats)，sham operation group(8 rats)and model group(24rats)．The line plug method was used to replicate the model in model group．After evaluation，the qualified rats were divided into model group and eye acupuncture group．So the groups were divided as follows:control group，sham operation group，model group and eye acupuncture group．After cerebral ischemia and reperfusion，The rats were treated with acupuncture immediately，then treated with acupuncture at every 8h until to 24h of ischemia reperfusion respectively．Immunohistochemical method detect MAPK three mainly subfamily P38MAPK pathway，ERK1/2 and JNK protein expression．Results compared with the control group，the levels of P38MAPK，JNK，ERK1/2 protein expression were significantly increased in the model control group and the eye acupuncture group，compared with the model group，the P38MAPK，JNK，ERK1/2 protein expression in rats hippocampus were significantly decreased．Conclusion:eye acupuncture may play a protective role in the p38-MAPK signal transduction pathway．

Eight Districts 8 Points;cerebral ischemia reperfusion;eye acupuncture;p38MAPK;JNK;ERK．

R246．8

B

1006-3250(2016)01-0239-03

2015-06-03

辽宁省科技厅博士科研启动基金项目(20131073);国家中医药管理局辽宁彭氏眼针学术流派传承工作室建设项目(LPGZS2012-09)

张 威(1978-)女，沈阳人，副主任医师，医学博士，从事针灸学与神经病学和眼针疗法的理论与临床研究。

△通讯作者:田维柱(1942)，男，辽宁海城市人，主任医师，博士研究生导师，从事针灸学与中医内科学以及眼针疗法的理论与临床研究。