泻肺汤对肺纤维化大鼠肺组织及血清自由基代谢的影响

安方玉， 刘永琦，3*， 骆亚莉， 李金田， 刘雪松， 史旭锋， 余 涛（.甘肃中医药大学系统生物学与中医药转化研究所，甘肃兰州730000；2.敦煌医学与转化省部共建教育部重点实验室，甘肃兰州730000；3.甘肃省中药药理与毒理学重点实验室中西医结合基础室，甘肃兰州730000；.甘肃中医药大学临床学院，甘肃兰州730000）



泻肺汤对肺纤维化大鼠肺组织及血清自由基代谢的影响

安方玉1，2， 刘永琦1，2，3*， 骆亚莉1， 李金田1，2， 刘雪松1， 史旭锋4， 余 涛4
（1.甘肃中医药大学系统生物学与中医药转化研究所，甘肃兰州730000；2.敦煌医学与转化省部共建教育部重点实验室，甘肃兰州730000；3.甘肃省中药药理与毒理学重点实验室中西医结合基础室，甘肃兰州730000；4.甘肃中医药大学临床学院，甘肃兰州730000）

摘要：目的 观察泻肺汤对博来霉素所致肺纤维化大鼠自由基代谢的影响，探讨泻肺汤防治肺纤维化可能的作用机制。方法 按照随机数字表法将SPF级SD大鼠随机分为正常对照组，模型对照组，泻肺汤低、中、高剂量组，阳性对照组，每组14只。除正常对照组外，采用经典的博来霉素气管内注射给药法制备大鼠肺纤维化模型，24 h后灌胃给药，正常对照组及模型对照组给予等体积生理盐水，泻肺汤低、中、高剂量组及阳性对照组，连续28 d。第29天腹主动脉采血处死大鼠，取肺组织标本。比色法观察肺组织NO的含有量、一氧化氮合成酶（NOS）的活性、超氧化物歧化酶（SOD）的活性、血清过氧化氢酶（CAT）的活性和羟脯氨酸（Hyp）的含有量。结果 与正常对照组相比，模型对照组大鼠体质量明显下降，肺重及肺系数明显升高，肺组织的NO含有量和NOS的活性均明显升高、SOD的活性明显降低，血清中CAT的活性明显降低、Hyp的含有量明显升高（P＜0.05或P＜0.01）。与模型对照组比较，泻肺汤高剂量组大鼠体质量明显升高，各干预组大鼠肺重及肺系数明显下降，肺组织的NO含有量和NOS活性均明显降低、SOD的活性明显增强，血清中CAT的活性明显增强、Hyp的含有量明显降低（P＜0.05或P＜0.01）。结论泻肺汤对肺纤维化具有一定的保护作用，呈现出量效关系。

关键词：泻肺汤；肺纤维化；自由基代谢；博来霉素

肺纤维化是以“弥漫性肺泡炎症、肺成纤维细胞灶的形成以及细胞外基质的反复修复和过度沉积”为主要病理特征［1］，以“永久性呼吸功能丧失”为最终结局，到目前为止，由于该病的发病机制未明，尚缺乏有效防治手段［2］。有研究发现，肺纤维化上皮细胞持续损伤可能是由氧化剂和抗氧化剂之间的失衡引起的，这种失衡进一步促进了肺泡上皮细胞的损伤，加速了肺纤维化的发生和发展。因此，治疗特发性肺纤维化（IPF）的有效方法可以通过调节细胞氧化应激状态来实现［3］。泻肺汤选自《辅行诀脏腑用药法要》，其主要由葶苈子、大黄、生地黄、竹叶、甘草5味药组成，功效泻肺涤痰，凉血止血。已有研究发现，其组方中的葶苈子、生地黄、大黄及甘草在不同的方剂组成中都有抗纤维化作用［4-7］，推测其组成的泻肺汤可能对肺纤维化疾病有防治作用。为此，本实验从抗氧化方面入手，通过观察其对博来霉素诱导肺纤维化大鼠肺组织中超氧化物歧化酶（SOD）活性、一氧化氮合成酶（NOS）活性、一氧化氮（NO）含有量的影响及其血清中过氧化氢酶（CAT）和羟脯氨酸（Hyp）含有量的影响，探讨泻肺汤抗肺纤维化的作用机理。

1 材料

1.1 动物 选择SPF级SD大鼠，体质量180～220 g，由甘肃中医药大学科研实验中心动物培育室提供，动物生产许可证号SCXK（甘）2011-0001。

1.2 实验药物与主要试剂 醋酸泼尼松片（江苏鹏鹤药业有限公司生产，批号1402191，国药准字H32011728），按照临床用量换算，临用前以蒸馏水溶解，配成0.2 mg/mL混悬液。敦煌古医方泻肺汤选自《辅行诀脏腑用药法要》，该方主要由葶苈子、生地黄、生大黄、竹叶、甘草5味药组成（购自甘肃冠兰中药饮片有限公司，批号分别为130101、131209、131211、131205、121212）；泻肺汤为自制汤剂（低、中、高剂量，每1 mL药液分别相当于1、2、4 g生药）。博来霉素（日本化药株式会社，批号415A025），用生理盐水配成5 mg/kg药液备用。考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒、NO、NOS、SOD、CAT及Hyp检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，批号分别为20140820、20140805、20140820、220140820、20140826、20140815。

1.3 主要仪器 电子天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）；VIS-723N型分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）；Thermo Scientific微量加样枪（上海艾研生物科技有限公司）；XB-70雪花制冰机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；TD4-Ⅱ台式低速离心机（长沙平凡仪器仪表有限公司）。

2 方法

2.1 泻肺汤水煎剂的制备 按《辅行诀脏腑用药法要》配比及传统方法制备。取葶苈子、生地黄、生大黄、竹叶、甘草各45 g，1次4付药共900 g，放在药锅中，加5 400 mL双蒸水浸泡30 min，水煎1 h，将所得药液倒入烧杯中，再加5 400 mL双蒸水浸泡30 min，水煎1 h，将2次药液混合后用水提-醇沉法，结合水浴加热法浓缩至900 mL，药物质量浓度按原药材量计算为1 g/mL。按照同样的方法，分别再制备质量浓度按原药材量计算为2、4 g/m L的药物。上述浓缩好的药物用高压灭菌后，-4℃冰箱保存备用。

2.2 动物分组、肺纤维化模型的制备及给药 SPF级SD大鼠常规饮食及自由饮水1周后，采用随机数字表分组法将动物分为正常对照组，模型对照组，泻肺汤水煎剂低、中、高剂量组，阳性对照组（醋酸泼尼松组），每组14只。除了正常对照组外，各组大鼠采用10%水合氯醛麻醉，鼠架固定，碘伏常规皮肤消毒，Szapie1法［8］气管内注射博来霉素（5 mL/kg）复制肺纤维化模型，正常对照组采用同样的方法气管内注射生理盐水。术后次日，给各治疗组灌胃给药，泻肺汤低、中、高剂量为10、20、40 g/kg，分别相当于临床用量的0.5、1、2倍。换算方法为泻肺汤人用剂量为225 g/d；按照各种标准体质量实验动物单位体质量体表面积之比计算，低剂量大鼠用药计量为225/70× 6.05×0.5≈10 g/kg，中剂量为225/70×6.05≈20 g/kg，高剂量为225/70×6.05×2≈40 g/kg；醋酸泼尼松剂量为1.8 mg/kg，相当于临床用量的2倍（强的松成人量10 mg/d，按照各种标准体质量实验动物单位体质量体表面积之比计算，大鼠用药计量为10/70×6.05×2≈1.8 mg/kg）；正常对照组及模型对照组给予等量生理盐水，连续给药28 d。末次给药24 h后，连同正常对照组动物一起测定相关指标。

2.3 指标测定

2.3.1 肺系数的测定 造模后第29天，电子天平称各组动物的体质量。10%水合氯醛麻醉，腹主动脉取血法处死动物，固定大鼠，消毒皮肤，将颈部皮肤剪开，暴露出胸腔，仔细分离气管和肺脏，摘取双肺后放入4℃预冷的生理盐水中漂洗数次，并用吸水纸吸弃其水分，称量肺脏的重量，计算肺指数。肺指数（mg/g）＝肺质量/体质量［9］。2.3.2 肺组织自由基等指标的检测 将上述称完的肺脏剪取右肺下叶约0.25 g，在冰浴条件下按照1∶9的比例用电动匀浆器制备肺匀浆，4℃、3 000 r/min离心5～10 min，取上清液用比色分析法分别测定肺组织NO及蛋白的含有量，以及NOS和SOD的活性。

2.3.3 血清CAT和Hyp的测定 将腹主动脉的血液收集于10 mL塑料离心管中，室温静止2 h后，3 000 r/min离心5～10 min，取其血清，比色分析法测定CAT活性和Hyp的含有量。

2.4 统计学分析 采用SPSS 13.0软件进行数据的统计分析，实验数据均用（±s）表示，组间显著性差异用单因素方差分析，组间两两比较方差齐时用LSD分析，方差不齐时用Dunnett＇s法分析。显著性差异用P＜0.05表示。

3 结果

3.1 各组大鼠体质量、肺质量及肺指数检测结果 与正常对照组相比，模型对照组小鼠体质量明显下降，肺质量及肺指数均明显升高（P＜0.01）；各干预组小鼠体质量均明显下降，阳性对照组肺质量下降明显（P＜0.05或P＜0.01）。与模型对照组比较，泻肺汤高剂量组和阳性对照组小鼠体质量明显升高，各干预组小鼠肺质量及肺指数均显著降低（P＜0.05或P＜0.01）。见表1。

表1 各组动物体质量、肺质量及肺指数结果（±s，n＝14）

表1 各组动物体质量、肺质量及肺指数结果（±s，n＝14）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型对照组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

组别　　剂量/（g·kg-1）　　体质量/g　　肺质量/g　　肺指数/（mg·g-1）正常对照组　　—305.39±25.56　1.72±0.12　5.68±0.61模型对照组　　—　249.23±22.57**　2.04±0.19**　8.24±1.16**泻肺汤低剂量组　10　257.17±12.65**　1.78±0.10▲▲　6.92±0.47*▲泻肺汤中剂量组　20　263.94±13.38**　1.65±0.11▲▲　6.23±0.48▲▲泻肺汤高剂量组　40　269.15±21.16**▲　1.61±0.16▲▲　5.98±0.62▲▲阳性对照组　0.001 8　274.69±26.67**▲▲　1.57±0.12*▲▲　5.77±0.66▲▲

3.2 肺组织NO、NOS和SOD检测结果 与正常对照组相比，模型对照组小鼠NO的含有量、NOS的活性均升高，SOD的活性下降；泻肺汤低剂量组NO的含有量下降，各干预组的SOD的活性均下降（P＜0.05或P＜0.01）。与模型对照组比较，各干预组小鼠NO的含有量和NOS的活性均下降，SOD的活性均升高（P＜0.05或P＜0.01）。见表2。

表2 各组动物肺组织N0含有量、N0 S和S0 D活性的检测结果（±s，n＝14）

表2 各组动物肺组织N0含有量、N0 S和S0 D活性的检测结果（±s，n＝14）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型对照组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

组别 　　剂量/（g·kg-1）　 NO/（μmo1·g prot-1） NOS/（U·mg prot-1） SOD/（U·mg prot-1）正常对照组　　—36.57±9.12　7.02±1.44　165.89±18.06模型对照组　　—　50.69±5.16**　8.84±0.54**　100.19±16.66**泻肺汤低剂量组　10　46.26±4.78*　7.49±1.90▲　134.10±29.18**▲▲泻肺汤中剂量组　20　42.57±4.61▲▲　6.68±1.30▲▲　139.52±16.73**▲▲泻肺汤高剂量组　40　36.57±5.27▲▲　6.48±1.55▲▲　147.22±18.51*▲▲阳性对照组　0.001 8　34.32±5.00▲▲　6.38±1.40▲▲　149.75±21.17*▲▲

3.3 血清CAT和Hyp的检测结果 与正常对照组相比，模型对照组小鼠CAT活性明显下降，Hyp的含有量明显升高；各干预组小鼠CAT的活性均下降，Hyp的含有量除了泻肺汤低剂量组外均降低（P＜0.05或P＜0.01）。与模型对照组比较，各干预组小鼠CAT的活性均明显升高，Hyp的含有量均明显降低（P＜0.05或P＜0.01）。见表3。

表3 各组动物血清CAT活性和Hyp含有量的检测结果（±s，n＝14）

表3 各组动物血清CAT活性和Hyp含有量的检测结果（±s，n＝14）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型对照组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

组别 　 剂量/（g·kg-1）　 CAT/（U·mL-1）　 Hyp/（μg·mL-1）正常对照组　　—44.72±1.69　48.75±4.77模型对照组　　—　34.62±1.58**　59.98±6.07**泻肺汤低剂量组　10　37.18±1.76**▲▲　49.86±3.97▲泻肺汤中剂量组　20　40.24±1.73**▲▲　42.60±3.09**▲▲泻肺汤高剂量组　40　43.81±2.39▲▲　40.09±4.88**▲▲阳性对照组　0.001 8　42.24±1.28*▲▲　38.69±4.58**▲▲

4 讨论

多数学者认为，肺间质纤维化发病机制主要是大量细胞外基质成分（如胶原蛋白、弹性蛋白等）过度沉积，使原来正常有序的生理结构与功能遭到破坏，引起肺间质纤维化的发生［10］。而Hyp是机体胶原蛋白主要成分之一，约占其氨基酸总量的13%，因此，Hyp含有量是衡量肺间质纤维化严重程度的重要指标。

本研究结果充分证实，用博来霉素制备的肺纤维化大鼠模型组其血清中Hyp的含有量明显升高，与正常对照组比较，差异具有显著性（P＜0.01）；给予泻肺汤药物干预后，可显著降低肺纤维化大鼠血清中Hyp的含有量，与模型对照组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。提示泻肺汤抗纤维化的机理可能是通过降低Hyp的含有量而相对增强肺组织内胶原蛋白的降解实现的。

在生理条件下，机体自由基产生与清除之间保持着动态平衡状态。体内有一系列清除自由基的酶如过氧化氢酶（SOD）、一氧化氮合酶（NOS）及过氧化氢酶（CAT），能够随时清除机体产生的自由基。如果机体释放自由基的数量超过了机体的清除能力，或体内自由基产生正常，但是机体清除自由基的能力下降，二者都会导致体内自由基发生蓄积，从而使组织细胞发生损伤。在众多的器官损伤中，最易受损的靶器官是肺脏。另外，下呼吸道氧化/抗氧化之间的失衡是导致肺纤维化发病主要原因。因此，衡量肺纤维化药物疗效的标准之一增强机体清除氧自由基的能力。

SOD能清除体内产生的超氧阴离子自由基，是生物体抗氧化系统很重要的一类酶，其活性增加可以保护细胞免受损伤。NO作为机体的第二信使，具有扩血管、调控神经信息传递和免疫功能等生理功能。肺内NO的大量蓄积会加重肺损伤和促进肺成纤维细胞增殖的作用［11］。NOS是生成NO的关键酶，可以催化左旋精氨酸生成瓜氨酸和NO。NO的作用主要取决于体内自身的含有量，低浓度的NO通过增强线粒体的还原活性加重肺纤维，而高浓度的NO则通过增加肺部亚硝酸盐的积聚加重肺纤维化。CAT是催化过氧化氢产生水和氧的很重要的一类酶，也是机体抗氧化系统很关键的一类酶，可以降低机体的氧化应激能力，提高机体的抗氧化能力，避免组织细胞的损伤。本研究结果表明，肺纤维化模型组大鼠肺组织中SOD的活性及血清中CAT的活性均显著低于正常对照组（P＜0.01），肺组织NO含有量和NOS的活性均显著高于正常对照组（P＜0.01）；而给予泻肺汤药物干预后，各干预组可显著降低肺纤维化模型小鼠NO含有量和NOS的活性，显著升高SOD水平及血清CAT活性。提示SOD、CAT及NO代谢紊乱促进了肺纤维化的发生发展。

综上所述，泻肺汤防治纤维化的可能机制是：（1）通过调节NO代谢及提高抗氧化能力而实现的；（2）通过降低Hyp的含有量，间接增加了胶原蛋白的降解，减轻肺组织的纤维化程度而达到抗纤维化的目的。

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*通信作者：刘永琦（1973—），男，博士，教授，从事中药抗肿瘤的免疫机制。Te1：13919019578，E-mai1：1yq@gszy.edu.cn

作者简介：安方玉（1977—），女，硕士，讲师，从事中药抗肿瘤的分子生物学机制。Te1：13893639394，E-mai1：anfyuwsmh @ 163.com

基金项目：甘肃省科技厅自然科学基金第二批B类计划（B2014-8）；敦煌医学与转化省部共建教育部重点实验室开放基金（DHYX1213-013）

收稿日期：2014-12-22

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.03.040

中图分类号：I 285.5

文献标志码：B

文章编号：1001-1528（2016）03-0665-04