生殖激素调节颗粒细胞凋亡的机制研究进展

李彩萍

（广西水产畜牧学校，广西南宁 530021）

生殖激素调节颗粒细胞凋亡的机制研究进展

李彩萍

（广西水产畜牧学校，广西南宁 530021）

研究表明颗粒细胞凋亡是卵泡闭锁的重要原因，调控颗粒细胞凋亡的因素是多种的，而生殖激素如生长激素、抑制素、活化素、卵泡抑素等间接地和直接地对卵巢卵泡颗粒细胞凋亡发挥重要的综合调控作用，这些激素通过多种信号转导途径调节颗粒细胞的凋亡，成为卵泡的存活因子和死亡因子。这些途径相互交联，构成信号网络，与卵巢的旁分泌、内分泌、自分泌途径一起参与卵泡闭锁和颗粒细胞的凋亡。

生殖激素；颗粒细胞凋亡；机制研究

卵泡在发育到排卵前所发生的退化最终被清除的生理现象，人们称之为卵泡闭锁。在大多数哺乳动物及禽类中，70～99.9%的卵泡在排卵前发生闭锁。现已证实，卵泡闭锁主要是通过细胞凋亡来完成的，包括卵母细胞凋亡和颗粒细胞凋亡。卵母细胞的凋亡引发的卵泡闭锁主要发生在原始卵泡，初级卵泡及腔前卵泡，而颗粒细胞的凋亡主要发生在有腔卵泡和次级未排卵的卵泡。但目前比较一致的看法认为颗粒细胞的凋亡触发了卵泡闭锁，颗粒细胞的凋亡已经在鸡、猪、水牛、兔等多种动物上得到证实。

与细胞分裂分化的过程一样，细胞凋亡也是细胞在内外的复杂分子环境条件刺激之下所发生的一种基因调控反应。在卵巢卵泡颗粒细胞内参与细胞凋亡的因子是多样的，而激素被认为是调节颗粒细胞凋亡最主要的因子，它们通过旁分泌、内分泌及自分泌途径等多种信号途径参与颗粒细胞凋亡，从而调控卵泡闭锁。

1 促性腺激素参与的颗粒细胞凋亡的信号调控

促性腺激素与哺乳动物卵巢的卵泡募集、选择、分化及维持优势卵泡生长密切相关。当一卵泡波中出现大卵泡时（大约4mm）时FSH峰出现。卵泡募集和循环中FSH水平的轻微升高时间性联系，卵泡的选择与循环中FSH 水平的降低有关，当FSH峰降低到最低点时，未来的优势卵泡和最大的次级卵泡以相同的速率生长，一直到某一点时两者的生长速度明显不同，这一点被称为分化。然后LH浓度在分化开始后1d或2d急剧升高，刺激卵泡液中雌二醇的升高，从而维持优势卵泡的生长直至排卵。因此，FSH和LH被认为是卵泡的存活因子。大量的体内外研究表明，FSH能够单独或者与其他因子协同作用抑制颗粒细胞自发性凋亡。

信号转导研究表明，促性腺激素通过PKA/cAMP信号转导抑制颗粒细胞凋亡，而在此途径中首先发挥作用的是血管活性肠肽和垂体腺苷酸环化酶活性多肽（PACAP），它们能够刺激培养颗粒细胞的类固醇分泌以及cAMP的积累，cAMP的类似物dibutylrylcAMP也能模拟这一作用，并且8-bromo-cAMP也能促进颗粒细胞的存活。然而，PKA抑制剂H-89能快速地诱导培养的鸡排卵前卵泡颗粒细胞的凋亡而阻止促性腺激素的存活效应。此外，Tilly等人［1］提出促性腺激素促进细胞存活可能是通过激活PKA途径抑制促凋亡因子Bax，Apaf-1及caspase-3的表达，上调Bcl-2和BclxLONG的表达。与母鸡优势化前卵泡的颗粒细胞比较发现，排卵前的卵泡内颗粒细胞的bcl-2 mRNA水平和Bcl-xLONG蛋白明显地增高。认为抑凋亡蛋白在颗粒细胞内水平过高，可有效地结合及中和胞浆内促凋亡蛋白Apaf-1，Bad及Bax，从而防止卵泡闭锁。

也有证据表明促性腺激素，特别是FSH，能激活PKA途径外的多种途径，包括蛋白激酶B（PKB），蛋白激酶C（PKC），血清及糖皮质激素诱导的激酶途径（SgK），p42-p44细胞外信号调节激酶（ERK）以及促有丝分裂蛋白激酶信号途径（MAPK）。FSH是经过转录因子，NFκB激活PKC信号转导。而PKB蛋白家族是通过3-磷酰肌醇-依赖性激酶1磷酸化而激活的，促性腺激素激活PKB途径是不依赖PKA途径的，因此PKA抑制剂H-89不能抑制FSH诱导的PKB磷酸化。有证据表明SgK能调节颗粒细胞增生及在卵泡发育和黄体形成期间的分化［2］。FSH和LH上调颗粒细胞内SgK的表达，通过PI-3激酶-PKD 1 酶级联反应被激活，活化的SgK蛋白转移到核内，在细胞核调节转录因子的活性，包括Forkhead蛋白家族成员。经性未成熟大鼠的卵泡颗粒细胞研究证实，FSH可以诱导P38 MAPK磷酸化，并被PKA抑致剂H89抑制，而cAMP的类似物却可以模拟这种磷酸化现象，说明FSH诱导生成的cAMP及激活的PKA是激活颗粒细胞P38MAPK途径的必要条件。

2 甾体类激素参与的颗粒细胞凋亡信号调控

2.1 雌激素和雄激素

雌激素具有促进卵泡生长，雄激素具有促进卵泡闭锁及颗粒细胞凋亡的作用，二者之间有颉颃现象。据此，卵泡液内雄激素与雌激素的比值作为卵泡闭锁的生化指标之一，比值升高表明正在发生闭锁。

依据经典的受体学说，雌激素是通过与其胞质受体结合后调节蛋白表达而发挥其生理作用。但近些年研究表明，17β-E2能通过一种非基因性效应来调节胞内第二信使分子如Ca2+的变化，发挥其生理作用。也有研究指出卵巢卵泡内雌激素功能在于它作为活性氧清除剂，抑制卵泡颗粒凋亡。吴际等［3］分别用1μg/ml的雌激素和雄激素刺激体外培养的人卵巢颗粒细胞，用Northern 杂交技术检测Bcl-2和Bax蛋白的表达，发现与对照组比较，雌激素、雌激素加雄激素作用时bcl-2基因mRNA表达分别增加45%和20%左右，而雄激素作用时则下降35%左右，结果提示雌激素对颗粒细胞的作用机理可能与上调凋亡抑制基因Bcl-2 mRNA的表达有关，雄激素则可能与下调Bcl-2基因表达有关。

2.2 孕酮

卵巢颗粒细胞有孕酮的特异受体。P4可以抑制颗粒细胞凋亡，孕酮颉颃剂，RU486，能刺激卵泡闭锁和促进颗粒细胞凋亡。孕酮抑制颗粒细胞凋亡是通过结合其核内受体PR，随后调节基因的转录和细胞内的应答。有研究指出，大鼠卵泡颗粒细胞分为大小两类，只有小颗粒细胞内存在孕酮受体，并当孕酮与小颗粒细胞内的孕酮受体结合后，刺激合成和分泌bFGF，而分泌的bFGF再与大、小颗粒细胞膜上的bFGF受体结合，抑制颗粒细胞凋亡，从而同时维持和保护大、小颗粒细胞的生存能力。尽管如此，孕酮的抗凋亡效应并不都是通过PR来实施的。泌乳小鼠的乳腺上皮细胞并不表达PR，但孕酮仍能维持其细胞活性。皮质脂酮通过乳腺上皮细胞表达的肾上腺皮质激素受体（GR）可阻断细胞凋亡，因此孕酮可能结合及激活GR抗凋亡。

有研究指出核PR局部定位在胞浆膜上充当着孕酮膜受体［4］。然而从小鼠自然永生的颗粒细胞系抽提的RNA中却不能检测到PR mRNA，直到出现促性腺激素峰值后颗粒细胞才表达PR mRNA。这些结果说明PR不是孕酮在原代颗粒细胞或SIGCs的功能性膜受体。尽管对于孕酮的颗粒细胞功能性膜受体还未鉴定，但发现在原代颗粒细胞和SIGCs表达一种60kDa的蛋白，能结合孕酮。在配体斑点实验中使用该蛋白抗体发现，该蛋白定位在胞浆膜上与孕酮结合，孕酮通过该蛋白传导信号，可能非基因组的膜启动机制介导孕酮这一作用。然而，对于这一机制却了解得非常少，最近有研究表明孕酮通过维持基底水平的胞内游离 ［Ca2+］（［Ca2+］i）调控颗粒细胞凋亡［5］。同时，在孕酮影响［Ca2+］i及颗粒细胞活性方面，蛋白激酶G（PKG）是一个关键的调节点，药理动力学实验数据分析表明PKG参与孕酮的抗凋亡作用［6］。

3 促性腺激素释放激素（GnRH）参与的颗粒细胞凋亡信号调控

有大量的证据表明促性腺激素释放激素在体内外能促进颗粒细胞的凋亡，并具有时间、剂量的依赖性，并且促性腺激素释放激素受体阻断剂可完全阻断这种凋亡现象。信号转导机理研究提出，促性腺激素释放激素与受体结合，增加细胞内Ca2+水平及逆转磷酸化，可能PKC途径转导促性腺激素释放激素的促进细胞凋亡的作用。Park等人用促性腺激素释放激素类似物作用于体外培养的人黄体颗粒细胞，发现促性腺激素释放激素受体急剧表达，细胞内Ca2+增多，caspase-3，-8，-9活性增强。结果说明促性腺激素释放激素受体结合，通过细胞内第二信使激活caspase级联，引起颗粒细胞凋亡。

4 生长激素（GH）参与的颗粒细胞凋亡调控

生长激素，直接或经由IGF-1，抑制排卵前卵泡闭锁，增强细胞存活能力。当GH加入体外培养的牛卵泡颗粒细胞，能强烈地刺激颗粒细胞产生IGF、IGFBP-3和oxytocin，并明显降低颗粒细胞凋亡率。在颗粒细胞的培养液中加入低浓度的GH（1-100ng/ mL），可刺激E2释放，而高浓度的GH（10 mg/mL）抑制E2释放。PKA抑制剂，KT5720和Rp-cAMP，可完全或部分地阻碍GH刺激颗粒细胞释放IGF-1、IGFBP-3、oxytocin、P、E2，从而影响颗粒细胞的凋亡。因而可见，GH和cAMP/PKA在颗粒细胞内连锁控制着这些因子分泌及凋亡发生，说明GH的效应可能是通过cAMP/PKA系统转导的。

5 抑制素、活化素、卵泡抑素 参与的颗粒细胞凋亡信号调控

近年来，发现了来自卵巢的抑制素-激活素-卵泡抑素轴，它是调控FSH和LH分泌的新家族。抑制素和活化素是由α、βA、βB三种亚单位在二硫键联接下的不同组合形成的作用相反的两个二聚体。目前越来越多的报道指出，颗粒细胞所产生的抑制素和激活素对控制卵泡的发育起重要地调节作用，前者被认为是卵泡生存因子，而后者被认为是卵泡闭锁因子。

5.1 抑制素

目前研究抑制素调节颗粒细胞凋亡还未见报道，多认为抑制素参与卵母细胞凋亡以调节卵泡闭锁。在卵泡发育过程中，抑制素通过刺激雄激素产生而增加雌激素的合成，使其分化为优势卵泡，对邻近卵泡起到抑制作用，并引起这些卵泡的闭锁。抑制素有大分子形式（＞160 kDa）和小分子形式（34，58，77 kDa），大分子形式抑制素在卵泡峰及FSH峰33h内急剧表达，并在优势卵泡内维持24h，同时促进雌激素的合成及降低卵泡素的浓度，卵泡优势化后，在次级卵泡和小卵泡内小分子抑制素及卵泡素增多。因此，抑制素与雌二醇、卵泡素一起在卵泡的分化、优势选择及卵泡闭锁发挥重要作用，抑制素是否通过颗粒细胞的凋亡参与卵泡的闭锁还有待证实。

5.2 活化素和卵泡抑素

活化素是抑制素β亚基同型二聚体，竞争性结合活化素受体Ⅱ以抑制抑制素在垂体及卵巢内的作用。颗粒细胞分泌的活化素能增加FSH受体的表达和抑制素的合成，并且促进早期卵泡发育中颗粒细胞的增生和激素合成，而卵泡抑素调节活化素与受体的结合以中和活化素在垂体和卵巢的作用。活化素通过增加IGFBP-4的水平促进啮齿动物颗粒细胞的凋亡，这一作用不受LH的拮抗，而受卵泡抑素抑制；而活化素却能抑制早期有腔卵泡的细胞凋亡，并且具有剂量的依赖性，这一作用也能被卵泡抑素卵泡抑素抑制。因此，活化素参与的细胞凋亡可能与卵泡发育的阶段有关，并且受到卵泡抑素的调节。

6 结语

卵巢卵泡颗粒细胞凋亡是处在一个极其复杂的内环境控制下完成的，并具有高度的协调性。它不仅有下丘脑-垂体-卵巢轴调节作用，也有卵巢本身的旁分泌和自分泌因子的调控机制。但是生殖激素，如前所述，存在着很广泛的调节机制，不仅远距离地、间接地控制卵巢功能，而且在卵巢内（主要在颗粒细胞内）也发挥着十分显著的直接的（或相反的）调节作用。有大量的证据表明在颗粒细胞表明存在着多种激素的受体，这些激素与受体结合刺激多种途径以调节颗粒细胞的活动，启动细胞内存活基因或死亡基因的转录。此外，激素调节机制也与卵泡发育有关，这可能与不同阶段的卵泡内外环境有关。尽管如此，抑制素、活化素和卵泡抑素对颗粒细胞凋亡的影响机制还不是很清楚，它们通过何种途径调控细胞凋亡及卵泡闭锁的研究不是很透彻，还需要进一步的探讨。此外，这些途径构成一个网络，它们之间的交联对话仍有待我们深入探讨。

［1］ Hsu，S.Y.，Hsueh，A.J. Tissue-specific Bcl-2 protein partners in apoptosis：an ovarian paradigm［J］.Physiol.Rev，2000，（80）：593-614.

［2］ Gonzalez-Robayna，I.J.，Falender，A.E.，Ochsner，S.，et al. Follicle-stimulating hormone（FSH）stimulates phosphorylation and activation of PKB（PKB/Akt）and serum and glucocorticoid-induced kinase（Sgk）：evidence for A kinase-independent signaling by FSH in granulosa cells［J］.Mol.Endocrine.2000，（14）：1283-1300.

［3］ 吴际，张丽珠，李潭，等.性激素对人卵巢颗粒细胞凋亡的作用［J］.中华妇产科杂志，1998，3（33）：157-159.

［4］ V. Boonyaratanakornkit，M.P，Scott. V. Ribon，et al. Progesterone receptor contains a proline-rich motif that directly interacts with SH3 domains and activates c-Src family tyrosine kinases［J］. Mol. Cell，2001，8（2）：269-280.

［5］ J.J Peluso，G. Fernandez. A. Pappalardo，et al. Characterization of a putative memebrane receptor for progesterone in rat granulosa cells［J］. Biol. Reprod，2001，65（1）：94-101.

［6］ J.J. Peluso.Progesterone as a regulator of granulose cell viability［J］. Journal of Steroid Biochemistry&Molecular Biology，2003，（85）：167-173.

李彩萍（1980—），女，广西南宁人，硕士研究生，主要从事畜牧兽医中职教育工作，讲师。