岩藻黄素对脑胶质瘤细胞U87增殖及自噬的影响

刘钰罡，孙移坤，戴宜武

(1南方医科大学附属北京军区总医院临床学院附属八一脑科医院，北京 100700；2解放军医学院附属北京军区总医院临床学院附属八一脑科医院)



岩藻黄素对脑胶质瘤细胞U87增殖及自噬的影响

刘钰罡1，孙移坤2，戴宜武1

(1南方医科大学附属北京军区总医院临床学院附属八一脑科医院，北京 100700；2解放军医学院附属北京军区总医院临床学院附属八一脑科医院)

目的观察岩藻黄素对脑胶质瘤细胞U87增殖及自噬的影响。方法未经处理的U87细胞作为对照组，不同浓度岩藻黄素处理的U87细胞作为实验组，比较各组细胞生存率、细胞凋亡率及自噬体、自噬溶酶体数目和分布，另比较细胞亚显微结构、微管相关蛋白1轻链3 Ⅱ型/微管相关蛋白1轻链3Ⅰ型(LC3Ⅱ/LC3Ⅰ)、酵母自噬基因6同系物(Beclin1)。结果12.5、25、50、75 μmol/L岩藻黄素处理组细胞生存率分别为93.19%±5.88%、73.05%±2.33%、49.95%±1.59%、25.95%±1.40%，对照组为100.00%±1.35%，25、50、75 μmol/L岩藻黄素处理组分别与对照组比较，P均<0.05。25、50 μmol/L岩藻黄素处理组细胞凋亡率分别为12.00%±0.56%、31.97%±1.83%，对照组为2.97%±0.21%，各岩藻黄素处理组分别与对照组比较，P均<0.05。25、50 μmol/L岩藻黄素处理组细胞LC3-GFP融合蛋白转移至自噬体膜并呈斑点状分布于细胞质内，且斑点数目随药物浓度的升高而增加；对照组LC3-GFP融合蛋白弥散分布在胞质中。镜下可见对照组正常的细胞器结构；50 μmol/L岩藻黄素处理组可见大量的自噬小泡、自噬体及自噬溶酶体，其中可见尚未完全降解线粒体结构。25、50 μmol/L岩藻黄素处理组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ分别为0.86±0.05、0.89±0.04，对照组为0.65±0.01，各岩藻黄素处理组分别与对照组比较，P均<0.05；25、50 μmol/L岩藻黄素处理组Beclin1相对表达量分别为0.39±0.02、0.59±0.04，对照组为0.23±0.01，各岩藻黄素处理组分别与对照组比较，P均<0.05。结论岩藻黄素可有效抑制U87细胞增殖，并诱导自噬的发生。

岩藻黄素；胶质瘤；微管相关蛋白1轻链3 Ⅱ型；微管相关蛋白1轻链3 Ⅰ型；酵母自噬基因6同系物

胶质瘤是常见的颅内原发性肿瘤，分为少突神经胶质瘤和星形细胞瘤。星形细胞瘤是常见的原发性中枢神经系统肿瘤，根据组织学和预后评分可分为Ⅰ～Ⅳ级[1]，U87细胞属于Ⅳ级神经胶质母细胞瘤细胞[2]。胶质瘤预后较差，通过手术切除及术后放疗、化疗仍很难取得良好疗效。岩藻黄素是一种从海藻中提取的类胡萝卜素，其分子式中包含二烯烃、共轭羰基、乙酰基，这些特殊的官能团使岩藻黄素具有抗氧化活性[3～5]，可诱导肿瘤细胞凋亡和自噬[6]。现已证明，岩藻黄素可减少黑色素瘤细胞和骨肉瘤细胞的浸润和转移能力[7,8]。但少有岩藻黄素抑制神经胶质瘤生长及潜在机制的相关研究。本研究观察了岩藻黄素对U87细胞增殖及自噬的影响，旨在为其用于胶质瘤的治疗提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料U87细胞(中国医学科学院)；DMEM培养基和胎牛血清(Gibico公司，美国)；链霉素和青霉素(HyClone公司，美国)；MTT和岩藻黄素(Sigma公司，美国)；微管相关蛋白1轻链3(LC3)、酵母自噬基因6同系物(Beclin1)一抗及辣根酶过氧化物标记的二抗(Cell Signaling 公司，美国)；Annexin V-FITC/PI(BD公司，美国)。

1.2U87细胞培养将冻存于液氮中的U87细胞株取出，迅速放入37 ℃水浴中，并接种于DMEM培养基(含10%胎牛血清和100 μg/mL青霉素、链霉素)中，将培养皿放入37 ℃培养箱(95%湿度和5%CO2)中培养，每3 d传代1次，传代比例为1∶3，取对数生长期细胞进行下述实验。

1.3岩藻黄素对U87细胞生存率的影响观察采用MTT法。取对数生长期U87细胞，胰酶消化、离心，完全培养基重悬细胞，细胞计数后接种于96孔板中，细胞密度为4 000/孔，培养过夜后以不同终浓度(0、12.5、25、50、75 μmol/L)岩藻黄素处理24 h。利用MTT分析法检测细胞生存率，对照组和各处理组中分别加入MTT(工作浓度5 g/L)，37 ℃继续培养4 h，弃培养液，加入150 μL的DMSO充分溶解甲瓒结晶后，使用酶标仪于540 nm波长处测量吸光度值(A值)。计算细胞生存率，细胞生存率(%)=实验组A值/对照组A值×100%。

1.4岩藻黄素对U87细胞凋亡率的影响观察采用流式细胞仪。取对数生长期U87细胞，胰酶消化、离心，完全培养基重悬细胞，细胞计数后接种于6孔板中，细胞密度为1.5×105/孔，培养过夜后以不同终浓度(0、25、50 μmol/L)的岩藻黄素处理U87细胞24 h，胰酶消化，1 000 r/min离心，10 min收集细胞，每组加入Annexin V 5 μL及PI 5 μL，室温下避光孵育15 min，使用流式细胞仪检测细胞凋亡，使用CellQuest & ModFit分析凋亡率。

1.5岩藻黄素对U87细胞自噬体、自噬溶酶体数目和分布的影响观察取对数生长期U87细胞，胰酶消化、离心，无双抗培养基重悬细胞，细胞计数后接种于6孔板中的方形盖玻片上，细胞密度1.5×105/孔，待细胞融合至80%左右时，使用Lipofectamine 3000转染LC3-GFP质粒。取一个1.5 mL EP管，加入125 μL Opti-MEMⅠReduced Serum Medium和5 μL Lipofectamine 3000。向另一个1.5 mL EP管中加入125 μL Opti-MEM ⅠReduced Serum Medium，5 μL P3000和2.5 μg质粒DNA，轻吹混匀制成DNA稀释液。将两管轻混并室温放置5 min后加入细胞中，使之混匀。继续培养12 h后更换完全培养基，并分别加入不同浓度(25、50 μmol/L)的岩藻黄素处理。处理24 h后使用PBS冲洗两遍，4%多聚甲醛固定15 min，使用dapi fluoromount G封片。使用共聚焦显微镜拍照，观察自噬体、自噬溶酶体的数目和分布情况。

1.6岩藻黄素对U87细胞亚显微结构的影响观察采用透射电子显微镜。取对数生长期U87细胞，胰酶消化、离心，完全培养基重悬细胞，细胞计数后接种于培养皿中，细胞密度2×105/皿，培养过夜后，0、50 μmol/L岩藻黄素处理U87细胞24 h，收集细胞，用2.5%戊二醛磷酸缓冲液4 ℃下固定1 h，使用1%四氧化锇在固定及梯度脱水后环氧树脂包被。使用超微切片机切片后固定于铜网中，乙酸双氧铀和柠檬酸铅分别固定15、3 min。使用透射电子显微镜观察细胞亚显微结构。

1.7岩藻黄素对U87细胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1表达的影响采用Western blotting法。取对数生长期U87细胞，胰酶消化、离心，完全培养基重悬细胞，细胞计数后接种于培养皿中，细胞密度2×105/皿，培养过夜后加入不同终浓度(0、25、50 μmol/L)的岩藻黄素24 h，收集细胞，加入100 μL细胞裂解液，于冰上裂解30 min后以13 000 r/min离心15 min，吸取上清液至一干净的EP管并检测蛋白浓度。各组样本取总蛋白40 μg，经SDS-PAGE电泳，湿转至PVDF膜后封闭，加一抗4 ℃过夜，次日加入辣根过氧化物标记的二抗，室温孵育1 h，使用增强化学发光液显影。β-actin设为内参。使用ImageJ2X软件分别测定LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、Beclin1、β-actin灰度值。

2　结果

2.1细胞生存率比较12.5、25、50、75 μmol/L岩藻黄素处理组细胞生存率分别为93.19%±5.88%、73.05%±2.33%、49.95%±1.59%、25.95%±1.40%，对照组为100.00%±1.35%，25、50、75 μmol/L岩藻黄素处理组分别与对照组比较，P均<0.05。

2.2细胞凋亡率比较25、50 μmol/L岩藻黄素处理组细胞凋亡率分别为12.00%±0.56%、31.97%±1.83%，对照组为2.97%±0.21%，各岩藻黄素处理组分别与对照组比较，P均<0.05。

2.3细胞自噬体、自噬溶酶体数目和分布比较对照组U87细胞LC3-GFP融合蛋白均匀分布于胞质中；25、50 μmol/L岩藻黄素处理组细胞LC3-GFP融合蛋白转移至自噬体膜，并呈斑点状分布于细胞质内，且斑点数目随药物升高而增加。

2.4细胞亚显微结构比较对照组U87胞质内可见正常的细胞器结构。50 μmol/L岩藻黄素处理组可见大量的自噬小泡、自噬体及自噬溶酶体，其中可见尚未完全降解线粒体结构。

2.5细胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1比较25、50 μmol/L岩藻黄素处理组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ分别为0.86±0.05、0.89±0.04，对照组为0.65±0.01，各岩藻黄素处理组分别与对照组比较，P均<0.05；25、50 μmol/L岩藻黄素处理组Beclin1相对表达量分别为0.39±0.02、0.59±0.04，对照组为0.23±0.01，各岩藻黄素处理组分别与对照组比较，P均<0.05。

3　讨论

胶质瘤是常见的颅内原发性肿瘤(约60%)，根据组织学和预后评分可分为Ⅰ～Ⅳ级，U87细胞属于Ⅳ级胶质母细胞瘤细胞，具有恶性增殖的生长特性[1,9～11]，手术很难切除干净，且术后复发率高，平均生存周期短[12]。尽管目前手术治疗结合放疗和化疗取得了长足进步，但治疗效果并不理想，因此亟需新的治疗方法和治疗靶点[13]。研究[14～18]证明，维生素A和其中间代谢产物视黄酸具有抑制胶质瘤细胞生长，诱导其发生凋亡，阻滞细胞周期，抑制其侵袭和迁移的作用。岩藻黄素是一种类胡萝卜素，具有和视黄酸相同的化学结构，即共轭基团和羟基基团，可能是其发挥作用的分子基础。

细胞死亡分为程序性死亡和非程序性死亡两种，细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主有序的死亡，最早是1972年由Kerr等[19]根据形态学特征首先提出的。本研究发现，与对照组比较，25、50、75 μmol/L岩藻黄素处理组细胞生存率明显降低，并呈浓度依赖性，提示岩藻黄素可以有效抑制U87细胞增殖。本研究还发现，与对照组比较，25、50 μmol/L岩藻黄素处理组细胞凋亡率升高，提示岩藻黄素还通过其他途径诱导细胞的死亡。

自噬是一种程序性死亡，为进化过程中高度保守和至关重要的自我保护系统[20]，自噬亦称第二类程序性死亡。越来越多证据表明，化学药物或植物药物诱导的自噬，在治疗癌症和神经胶质瘤方面起到越来越重要的作用[21]。已有大量实验证实，自噬可以作为一种有效途径，在杀死肿瘤细胞中发挥重要作用，如姜黄素可以诱导胶质瘤自噬从而产生抗肿瘤效果[22]，神经酰胺可诱导胶质瘤细胞自噬性死亡[23]等。酸性小泡的形成和促进自噬小体的运输过程中，LC3蛋白的参与起重要作用[24]。在自噬发生时，LC3蛋白的总量特别是LC3Ⅱ蛋白表达量随之升高，LC3Ⅱ在组装溶酶体、自噬体及最后诱导激活自噬中起重要作用，其表达量亦反映自噬的程度[25,26]。Beclin1是被证实的第一个自噬相关肿瘤因子[27]，其杂合性降低是细胞发生恶变的转化因素之一[28,29]。有研究[30]表明，Beclin1一方面有利于吞噬泡的形成从而促进自噬体的形成，另一方面有助于自噬体的成熟[31]。本研究显示，相对于对照组，25、50 μmol/L岩藻黄素处理组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1表达升高，证实岩藻黄素可诱导U87细胞自噬的发生。LC3蛋白是自噬的关键蛋白，在LC3-GFP瞬时转染实验中发现，25、50 μmol/L组岩藻黄素处理后的U87细胞，LC3-GFP蛋白转移至自噬体膜并呈斑点状分布于细胞质内，且斑点数目随药物浓度的升高而增加，进一步证实岩藻黄素诱导了U87细胞自噬的发生。透射电子显微镜观察，50 μmol/L岩藻黄素处理组细胞中存在大量的自噬体、自噬溶酶体，提示U87细胞中细胞器的降解是通过岩藻黄素诱导其自噬的发生。

总之，我们发现岩藻黄素可以抑制U87细胞的增殖，并诱导U87细胞的凋亡，进一步证明岩藻黄素可以诱导U87细胞的自噬性死亡，提出自噬可能成为一种新的抗瘤途径，其主要的机制是通过形成自噬溶酶体降解和消化细胞器、蛋白、DNA碎片发挥杀伤作用。

[1] Rao JS. Molecular mechanisms of glioma invasiveness: the role of proteases[J]. Nat Rev Cancer, 2003,3(7):489-501.

[2] Dunbar E, Yachnis AT. Glioma diagnosis: immunohistochemistry and beyond[J]. Adv Anat pathol, 2010,17(3):187-201.

[3] Hu T, Liu D, Chen Y, et al. Antioxidant activity of sulfated polysaccharide fractions extracted from Undaria pinnitafida in vitro[J]. Int J Biol Macromol, 2010,46(2):193-198.

[4] Sachindra NM, Sato E, Maeda H, et al. Radical scavenging and singlet oxygen quenching activity of marine carotenoid fucoxanthin and its metabolites[J]. J Agric Food Chem, 2007,55(21):8516-8522.

[5] Heo SJ, Jeon YJ. Protective effect of fucoxanthin isolated from Sargassum siliquastrum on UV-B induced cell damage[J]. J Photochem Photobiol, 2009,95(2):101-107.

[6] Heo SJ, Ko SC, Kang SM, et al. Cytoprotective effect of fucoxanthin isolated from brown algae Sargassum siliquastrum against H2O2-induced cell damage[J]. Eur Food Res Technol, 2008,228(1):145-151.

[7] Chung TW, Choi HJ, Lee JY, et al. Marine algal fucoxanthin inhibits the metastatic potential of cancer cells[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2013,439(4):580-585.

[8] Rokkaku T, Kimura R, Ishikawa C, et al. Anticancer effects of marine carotenoids, fucoxanthin and its deacetylated product, fucoxanthinol, on osteosarcoma[J]. Int J Oncol, 2013,43(4):1176-1186.

[9] Ahn BH, Min G, Bae YS, et al. Phospholipase D is activated and phosphorylated by casein kinase-Ⅱ in human U87 astroglioma cells[J]. Exp Mol Med, 2006,38(1):55-62.

[10] Camphausen K, Purow B, Sproull M, et al. Orthotopic growth of human glioma cells quantitatively and qualitatively influences radiation-induced changes in gene expression[J]. Cancer Res, 2005,65(22):10389-10393.

[11] Nakada M, Niska JA, Miyamori H, et al. The phosphorylation of EphB2 receptor regulates migration and invasion of human glioma cells[J]. Cancer Res, 64(9):3179-3185.

[12] Soffietti R, Kocher M, Abacioglu UM, et al. A european organisation for research and treatment of cancer phase Ⅲ trial of adjuvant whole-brain radiotherapy versus observation in patients with one to three brain metastases from solid tumors after surgical resection or radiosurgery: quality-of-life results[J]. J Clin Oncol, 2013,31(1):65-72.

[13] Corwin D, Holdsworth C, Rockne RC, et al. Toward patient-specific, biologically optimized radiation therapy plans for the treatment of glioblastoma [J]. PLoS One, 2013, 8(11):e79115.

[14] Tani E, Morimura T, Kaba K, et al. Preliminary study of the effects of vitamin A on antineoplastic activities of chemotherapeutic agents in glioma[J]. Neurol Med Chir, 1980,20(7):665-677.

[15] Yung WA, Lotan R, Lee P, et al. Modulation of growth and epidermal growth factor receptor activity by retinoic acid in human glioma cells[J]. Cancer Res, 1989,49(4):1014-1019.

[16] Gumireddy K, Sutton LN, Phillips PC, et al. All-trans-retinoic acid-induced apoptosis in human medulloblastoma: activation of caspase-3/poly(ADP-ribose) polymerase 1 pathway[J]. Clin Cancer Res, 2003,9(11):4052-4059.

[17] Ying M, Wang S, Sang Y, et al. Regulation of glioblastoma stem cells by retinoic acid: role for Notch pathway inhibition[J]. Oncogene, 2011,30(31):3454-3467.

[18] Liang C, Yang L, Guo S. All-trans retinoic acid inhibits migration, invasion and proliferation, and promotes apoptosis in glioma cells in vitro[J]. Oncol Lett, 2015,9(6):2833-2838.

[19] Kerr JF, Wyllie AH, Currie AR. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics[J]. Br J Cancer, 1972,26(4):239-257.

[20] Edinger AL, Thompson CB. Death by design: apoptosis, necrosis and autophagy[J]. Curr Opin Cell Biol, 2004,16(6):663-669.

[21] Shinojima N, Yokoyama T, Kondo Y, et al. Roles of the Akt/mTOR/p70S6K and ERK1/2 signaling pathways in curcumin-induced autophagy[J]. Autophagy, 2007,3(6):635-637.

[22] 倪琦,曾思恩,谭宁,等.姜黄素对肝癌Hep1细胞增殖及凋亡的影响[J].山东医药,2010,50(7):6-8.

[23] 张露勇,罗菲亚,胡培丽,等.神经酰胺通过JNK-C-Jun信号通路诱导胶质瘤细胞自噬性死亡[J].首都医科大学学报,2015,35(2):276-281.

[24] Matsushita M, Suzuki NN, Obara K, et al. Structure of Atg5.Atg16, a complex essential for autophagy[J]. J Biol Chem, 2007,282(9):6763-6772.

[25] Qu X, Yu J, Bhagat G, et al. Promotion of tumorigenesis by heterozygous disruption of the beclin 1 autophagy gene[J]. J Clin Invest, 2003,112(12):1809-1820.

[26] Shimizu S, Kanaseki T, Mizushima N, et al. Role of Bcl-2 family proteins in a non-apoptotic programmed cell death dependent on autophagy genes[J]. Nat Cell Biol, 2004,6(12):1221-1228.

[27] Yu L, Alva A, Su H, et al. Regulation of an ATG7-beclin 1 program of autophagic cell death by caspase-8[J]. Science, 2004,304(5676):1500-1502.

[28] Adams JM, Cory S. The Bcl-2 protein family: arbiters of cell survival[J]. Science, 1998,281(5381):1322-1326.

[29] Antonsson B, Martinou JC. The Bcl-2 protein family[J]. Exp Cell Res, 2000,256(1):50-57.

[30] Wirawan E, Lippens S, Vanden Berghe T, et al. Beclin1: a role in membrane dynamics and beyond[J]. Autophagy, 2012,8(1):6-17.

[31] Yin X, Cao L, Kang R, et al. UV irradiation resistance-associated gene suppresses apoptosis by interfering with BAX activation[J]. EMBO Rep, 2011,12(7):727-734.

Effect of fucoxanthin on proliferation and autophagy of human glioma U87 cells

LIU Yugang1, SUN Yikun, DAI Yiwu

(1 Clinical College of General Hospital of Beijing Military Region, Southern Medical University, Beijing 100700, China)

ObjectiveTo observe the effect of fucoxanthin on the proliferation and autophagy of glioma U87 cells. MethodsThe untreated U87 cells were taken as the control group, and U87 cells treated with different concentrations of fucoxanthin were taken as the experimental group. The viability, the apoptosis rate, the number and distribution of autophagosome and autolysosome were compared between different groups. Meanwhile, the cell ultrastructure, microtubule-associated protein 1 light chain 3Ⅱ/microtubule-associated protein 1 light chain 3Ⅰ (LC3Ⅱ/LC3Ⅰ), and Beclin-1 were compared between the two groups.ResultsThe cell survival rates of the experiment groups treated with 12.5, 25, 50 and 75 μmol/L fucoxanthin were 93.19%±5.88%, 73.05%±2.33%, 49.95%±1.59% and 25.95%±1.40%, respectively. The viability of the control group was 100.00%±1.35%. Significant difference was found between the experimental groups treated with 25, 50, 75 μmol/L fucoxanthin and the control group (all P<0.05). The apoptosis rates of the experimental groups treated with 25 and 50 μmol/L fucoxanthin were respectively 12.00%±0.56% and 31.97%±1.83%, and it was 2.97%±0.21% in the control group (all P<0.05). Fucoxanthin induced autophagy in dose-dependent manner, which was assayed by transient transfection of LC3-GFP. Compared with the control group, there were more lysosome and autophagolysosomes, indicated by LC3-GFP, in U87 cells treated with fucoxanthin (25 and 50 μmol/L). Fucoxanthin-treated cells displayed many lysosome and autophagolysosomes which were observed by transmission electron microscopy. In the experiment groups treated with fucoxanthin (25 and 50 μmol/L), the expression of LC3Ⅱ/LC3Ⅰand Beclin1 was 0.86±0.05, 0.89±0.04 and 0.39±0.02, 0.59±0.04.In the control group, the expression of LC3Ⅱ/LC3Ⅰand Beclin1 was 0.65±0.01 and 0.23±0.01.Compared with the control group, autophagic-related protein expression of LC3Ⅱ/LC3Ⅰand Beclin1 was significantly increased in the experimental groups (all P<0.05). ConclusionFucoxanthin can effectively inhibit the proliferation of U87 cells and induce autophagy.

fucoxanthin; glioma; microtubule-associated protein 1 light chain 3 II; microtubule-associated protein 1 light chain 3 I; Beclin1

国家自然科学基金资助项目(81271391)。

刘钰罡(1989-)，男，在读硕士，主要研究方向为抗胶质瘤相关机制。E-mail: 332074883@qq.com

简介：戴宜武(1964-)，男，博士，教授，博士生导师，主要研究方向为神经干细胞增殖分化相关机制及抗胶质瘤相关机制的神经修复。E-mail: dyw100200@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.15.002

R739.4

A

1002-266X(2016)15-0004-04

2016-01-18)