补肾活血方对骨关节炎大鼠关节滑液IL-1β水平及滑膜MMP-9 mRNA表达的影响

梁延琛,李念虎,丁英杰,丛海波

(1山东中医药大学第一临床医学院，济南250021；2山东中医药大学附属医院；3威海市中心医院)



补肾活血方对骨关节炎大鼠关节滑液IL-1β水平及滑膜MMP-9 mRNA表达的影响

梁延琛1,2,李念虎2,丁英杰3,丛海波3

(1山东中医药大学第一临床医学院，济南250021；2山东中医药大学附属医院；3威海市中心医院)

摘要：目的观察补肾活血方对骨关节炎(OA)大鼠关节滑液白细胞介素1β(IL-1β)及关节滑膜基质金属蛋白酶9(MMP-9)表达的影响。方法 取20只采用Hulth法OA造模成功的SD大鼠，随机分为观察组和对照组各10只，分别给予自拟补肾活血方制剂、等量淀粉混悬液灌胃6周。采用酶免疫分析(RIA)法检测关节滑液中的IL-1β，采用RT-PCR法检测关节滑膜中的MMP-9 mRNA。结果观察组和对照组关节滑液IL-1β水平分别为(2.25±0.13)、(5.37±0.68)pg/mL,关节滑膜MMP-9 mRNA表达量分别为0.31±0.05、0.68±0.03。观察组大鼠关节滑液IL-1β水平和关节滑膜MMP-9 mRNA表达量均低于对照组，P均<0.05。结论 补肾活血方灌胃可以抑制OA大鼠关节滑膜细胞分泌IL-1β及关节滑膜中MMP-9 mRNA表达。

关键词：补肾活血方；骨关节炎；白细胞介素1β；基质金属蛋白酶9

骨关节炎(OA)是一种慢性、渐进性、退行性的关节病变，以膝关节OA的发病率最高。其主要病理学特征是关节软骨变性破坏、软骨下骨硬化、关节表面骨赘形成、滑膜增生、关节间隙变窄等。OA的病因复杂，发病机制尚不清楚，目前认为其是在生物学和力学因素共同作用下导致的软骨细胞、软骨下骨及细胞外基质三者合成和降解稳态失衡的退行性关节疾病。补肾活血方是我院李念虎教授自拟的一种治疗OA的方剂，临床应用有效[1,2],但作用机制不明。2015年3～5月，我们观察了补肾活血方对OA大鼠关节滑液IL-1β水平和关节滑膜基质金属蛋白酶9(MMP-9)基因表达的影响。现报告如下。

1材料与方法

1.1动物模型制作SPF级SD 大鼠26只，鼠龄3个月，未孕，雌雄各半，体质量(220±20)g，由山东中医药大学实验动物中心提供。采用Hulth法[3]行OA造模。取大鼠后肢膝关节内侧纵行手术入路，切断前后交叉韧带、内侧副韧带，切除内侧半月板，术中避免损伤关节软骨。术后每鼠每天肌注青霉素钠预防术后感染。术后第3天开始强迫大鼠每天早晚活动1次，每次时长为半小时，连续6周。普通饲料喂养。随机抽取3只处死，解剖下肢膝关节，取股骨远端、胫骨近端关节面行形态学检测。肉眼观察见股骨远端、胫骨近端关节面均表面粗糙，欠规整。再对切取的关节面行HE染色，光学显微镜下见关节软骨表面变薄，软骨细胞减少，呈退行性改变；软骨下骨小梁变细，排列紊乱，连续性差；滑膜增生肥厚。肉眼及光学显微镜观察均证实OA造模成功。

1.2分组与处理从剩余OA造模成功大鼠中选取20只，随机分为观察组和对照组各10只，分别给予自拟补肾活血方制剂6 mL和等量淀粉混悬液，每天早晚各灌胃1次，连续给药6周。其间大鼠正常饲养，不再强迫其活动。补肾活血方由熟地黄、附子、丹参、巴戟天、仙茅等中药组成。

1.3关节滑液IL-1β检测在两组大鼠一侧后肢膝关节内注入无菌生理盐水0.2 mL，混匀后抽取关节液，用酶免疫分析法(RIA)检测IL-1β。每份标本至少检测3次，取平均值。

1.4关节滑膜MMP-9 mRNA表达检测取两组大鼠另一侧后膝关节滑膜。采用TRIzol法提取滑膜组织RNA，琼脂糖电泳进行纯度检测。用反转录-多聚酶链反应法(RT-PCR)检测关节滑膜中MMP-9 mRNA表达，操作按试剂盒说明书进行，结果以目的条带与β-actin条带的灰度值之比表示。

2结果

观察组和对照组关节滑液IL-1β水平分别为(2.25±0.13)、(5.37±0.68)pg/mL,关节滑膜MMP-9 mRNA表达量分别为0.31±0.05、0.68±0.03。观察组大鼠关节滑液IL-1β水平和关节滑膜MMP-9 mRNA表达量均低于对照组，P均<0.05。

3讨论

OA属于祖国医学中“痹症”、“骨痹”范畴。中医骨伤科学认为，OA发病机制是肾虚为本，血瘀为标，本虚标实，本痿标痹。肝藏血、主筋，肾藏精、主骨，肝肾亏虚，精血不足，则致筋骨失养，经脉闭阻，不通则痛，易感风寒湿邪而发为“痹”。《素问·痹论篇》云：“骨痹者，肝肾亏虚，化生不足，因虚邪之风，寒湿邪至，两虚相得，乃客其形”，认为骨痹是肝肾亏虚致正气不足，风寒湿邪乘虚而入，正邪相搏，经络痹阻，是其主要的发病机制。《张氏医通》曰：“膝者，筋之府，膝痛无有不因肝肾虚者，虚则风寒湿气袭之。”认为骨痹的主要内因是肝肾亏虚，风寒湿邪是其发病的重要外因。祖国医学历代名家及典籍基本上一致认可本病本虚标实的病机，不同主要是在其中医症候方面，有重于肝而有重于肾者，有重于瘀而有重于邪者[4]。

针对“骨痹”发病机制，李念虎教授结合古籍及多年临床实践，重视OA“本虚标实，本痿标痹”的特点，自拟补肾活血方，并在多年临床实践中取得了满意的疗效。此方中，熟地黄滋阴补血、益精填髓，附子回阳救逆、散寒止痛，二者共为君药；丹参活血消痈、祛瘀止痛，为臣药；巴戟天补肾助阳、祛风除湿；仙茅温肾壮阳、驱寒除湿，共为佐药。此补肾活血方药味不在多而在精，药效重在标本兼治，补肾兼以强筋，活血而不破血，从而达到治疗OA的目的。

近年来国内外研究证实[5]，细胞因子在OA发生发展的病理生理过程中起着重要作用，其中IL-1及TNF-α是关节炎病理过程中促进软骨基质降解和关节软骨破坏的两种最重要的细胞因子[6]。IL-1β在OA发生的病理生理过程中处于核心地位[7]，可以发挥以下作用：①改变软骨细胞的正常结构和功能，促进软骨细胞非正常性的凋亡；②改变软骨基质中胶原蛋白的含量，减少Ⅱ型胶原蛋白的合成，并降低Ⅱ型胶原蛋白的基因表达，使其易于被基质金属蛋白酶(MMPs)降解；③通过诱导MMPs的高表达和活性增加，促进软骨基质中胶原蛋白的降解[8]；④可以激发关节滑膜中炎性介质的高合成及高表达，促使关节内微环境的炎症反应加重。

MMPs是一组Zn2+、Ca2+依赖的蛋白水解酶，其结构具有高度同源性，均由10个外显子和9个内含子组成，在中性pH条件下能水解包括胶原蛋白、蛋白聚糖、纤维粘连蛋白等在内的绝大部分细胞外基质[9]。MMP-9属于 MMPs中的明胶酶亚型，具有降解胶原蛋白明胶、弹性蛋白的高度特异的能力。在OA的演进过程中，MMP-9可加快软骨基质中胶原蛋白、弹性蛋白的降解速度，致使以Ⅱ型胶原蛋白为主体的软骨基质网状框架结构大量破坏，关节软骨肿胀，抵抗外力作用下降，最终导致关节软骨出现不可逆的永久性破坏[10]。

本研究结果证实，补肾活血方可降低OA关节滑液中IL-1β的水平，同时使关节滑膜中MMP-9 mRNA表达明显减少。其可能机制是补肾活血方采用补肾法上调性激素水平，提高超氧化物歧化酶活性，清除氧自由基，从而促进软骨细胞增殖，抑制软骨细胞凋亡，减缓软骨细胞退行性变；活血法改善微循环，降低骨内压，抑制滑膜中炎症反应，促进关节软骨修补；两者有机地结合为一个统一的整体，最终针对OA的发病机制，调节异常变化的细胞因子的水平，抑制基质金属蛋白酶含量和活性的异常增高，从而达到治疗OA的目的。

参考文献：

[1] Li NH. Clinical observation of bushen huoxue formula treating early osteoarthritis of the knee[J].J Tradit Chin Orthoped Traumatol, 2006,18(10):11-12.

[2] Li NH. Effects of serum containing Bushen Huoxue drugs on level of TNF-α and IL-1β of synovioctye[J]. China J Orthopaed Traumatol, 2007,20(5):302-303.

[3] Rogart JN, Barrach HJ, Chichester CO. Articular collagen degradation in the hulth-telhag model of osteoarthritis[J]. Osteoarthritis Cartilage, 1999,7(6):539-547.

[4] Li NH. Review of differential treatment of osteoarthritis of the knee[J]. Shandong J Tradit Chin Med, 2005,24(5):331-334.

[5] Chikanza I, Fernandes L. Novel strategies for the treatment of osteoarthritis[J]. Expert Opin Investig Drugs, 2000,9(7):1499.

[6] Sandra K, Leo AB, Alison MB, et al. Different roles of tumour necrosis factor-α and interleukin-1 in murine streptococcal cell wall arthritis[J]. Cytokine, 1998,10(5):690-702.

[7] Blom AB, van der Kraan PM, van der Berg WB. Cytokine targeting in osteoarthritis[J]. Curr Drug Targets, 2007,8(2):283-292.

[8] Gupta S. A decision between life and death during TNF-α induced signaling[J]. J Clin Immunol, 2002,22(4):185-194.

[9] 董刚,周辉. 金属蛋白酶在骨关节炎软骨内环境中的表达与调控[J]. 中国骨伤,2009,22(2):156.

[10] Bassiouni HM, Deeb M, Kenawy N, et al. Phonoarthorgraphy, musculoskeletal ultrasonography and biochemical biomarkers for the evaluation of keen cartilage in osteoarthritis[J]. Mod Rheumatal, 2011,21(5):500-508.

(收稿日期：2015-10-12)

中图分类号：684.3

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)06-0036-02

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.06.012

通信作者：丛海波(E-mail: haibocong@163.com)

基金项目：山东省自然科学基金资助项目(2009ZRA01218)。