抑制性差减杂交技术（SSH）及其应用研究进展

梅冰，陆翔，窦法楷，汪慧莲，李显秋，王永乔

（云南农业大学建筑工程学院，云南农业大学节能减排检测工程中心，云南昆明650000）

抑制性差减杂交技术（SSH）及其应用研究进展

梅冰，陆翔，窦法楷，汪慧莲，李显秋，王永乔

（云南农业大学建筑工程学院，云南农业大学节能减排检测工程中心，云南昆明650000）

抑制性差减杂交技术是一种差异性基因克隆的新技术，它对研究细胞生殖、发育、分化、衰老及死亡等生命过程中有关基因的差异表达及相关基因的分子克隆提供了有力的技术工具。简要概述了抑制性差减杂交技术的基本原理、优越性、缺陷及其在相关基因克隆方面的应用研究进展。

基因克隆；抑制性差减杂交；应用

生物体的生命过程伴有异常复杂的生物生化变化，是生物体内相关基因的有序表达和调控的结果。对相关差异性表达基因进行深入研究，能够更加深入地了解生物体的生命活动规律。目前，分离差异性表达基因的主要技术为杂交技术（subtrac tive hybridization）和差示筛选技术（differential screening），但这些技术存在重复性差、敏感度低等缺点。随着现代PCR技术的发展，一系列基于PCR技术的分离差异性基因表达的新技术被开发出来。SSH技术就是一种利用抑制性PCR和以差减杂交技术为基础的一种简单、快速地分离差异性表达基因的方法，该技术在研究基因克隆、基因表达及基因功能等方面有明显的优势[1]。笔者对使用SSH技术进行研究的应用现状及其未来前景进行了简单介绍，旨在使SSH技术的应用得到更加深入的认识。

1 SSH技术的过程及其优缺点

1.1 SSH技术的过程

SSH研究应用的材料可以是基因组DNA，也可以是cDNA，用于分离克隆2个样品中特异基因或者是差异性表达的基因。基本过程是：抽提2种不同生物体的DNA或cDNA；将经限制性内切酶消化后的Tester DNA分为2个部分，分别与2种接头连接；再将这2个部分序列于过量酶切的Driver DNA杂交，当这2个部分DNA被最终混合杂交后，就允许了同源性的单链DNA分子杂交；通过PCR扩增、克隆即可分析所差减的序列。

1.2 SSH技术具有的优点[2]

高效高速。在一次SSH杂交试验过程中，就可以同时分离出上百个差异性表达的基因。灵敏度高。在退火时，高丰度的单链DNA同源杂交的速度快于低丰度的单链DNA，导致原来在丰度上有差别的单链DNA在相对含量上能够达到一致，从而对于低丰度的基因也可以通过基因克隆表达出来。假阳性率低。经过2次杂交和2次PCR扩增选择性地扩增差异表达目的DNA片段，提高了特异基因的筛出率，使得假阳性率大大降低。简单易行，对仪器设备要求不高。背景低、重复性高。

1.3 SSH技术存在的不足[2]

基因组中酶切位点较少的不适用SSH技术；分离到的差异表达基因片段，还需要扩增全长；起始材料相对要求较多，不适于来源困难的样品；对试验材料的要求较高，试验材料间差异性要求较低。

2 SSH技术的应用

2.1 SSH技术在医学上的应用

孙守娟等[3]采用SSH技术，构建了舌鳞癌Tca 8113细胞系中高、低醛脱氢酶活性细胞差异表达基因cDNA文库，用Trizol分别提取2个细胞的总RNA；用SSH技术对2组RNA进行差异基因筛选和扩增，克隆片段均匀分布在250～750 bp，无假阳性克隆。测序结果经同源性比对分析可知，与肿瘤有关的基因有SLC25，A13 NPC1，KLHL2，BARD1，WAPL，Notch2，EEF2K。车红花等[4]通过SSH技术，克隆了受病毒攻击的宿主细胞中被中药有效成分调控的基因，结果显示，核糖体蛋白L27a在中药组中高表达，病毒组中表达减弱或被抑制；益气活血中药复方能够影响受CVB3攻击的宿主细胞核糖体蛋白L27a的表达，有效保护心肌、阻断病程进度，实现治疗病毒性心肌炎的目的。

李守明等[5]采用抑制性差减杂交技术，鉴定母鼠铅暴露后代海马差异表达基因，构建了一个近200个克隆的差减基因文库，得到93个有效克隆，从中克隆和鉴定了母鼠铅暴露致使学习和记忆能力显著下降的幼鼠中海马差异表达的基因，共43种不同的基因以及4种未知功能基因。这些基因包括一些看家基因和一些与细胞蛋白折叠、信号传导、应激响应及DNA甲基化相关功能的基因。

2.2 SSH技术在植物学上的应用

刘蕾等[6]应用SSH筛选植物青枯菌致病相关基因，研究该菌株致病力分化机理，以Po82为待测菌株，构建了抑制性差减杂交文库，结果表明，具有较高的接头连接以及文库构建效率，插入片段平均长度为300 bp，文库构建质量较好。对文库中随机挑取阳性克隆进行测序，共筛选出44个Po82菌株差异基因。生物信息学分析结果表明，所得差异基因主要涉及新陈代谢、膜结构、转坐酶、毒力、分泌蛋白、转录因子以及未知功能等。闵卓等[7]以赤霞珠葡萄新梢上冬芽和夏芽为材料（夏芽作为驱动方，冬芽作为试验方），采用SSH技术构建冬芽和夏芽的cDNA文库，筛选冬芽和夏芽差异表达的基因片段，结果发现了一些在冬芽中表达频率较高的基因，如编码MADS FLC-like蛋白、钙依赖蛋白激酶、NADP依赖型的苹果酸酶、细胞壁水解酶、细胞壁松弛蛋白、外被体蛋白β亚基、热激蛋白、衰老相关蛋白、细胞色素P450、细胞壁关联蛋白等基因；同时还认为，线粒体蛋白基因、开花相关基因、未知蛋白基因、ATP合成酶β亚基基因、MADs FLC-like蛋白基因等与葡萄芽生理休眠具有相关性。叶晓明等[8]以温敏雄性不育系K121S在可育温度10℃下和不育温度26℃下三核期花蕾为材料，以可育温度下的cDNA为驱动子，采用SSH技术构建了不育温度下SSH文库，随机挑选97个阳性菌落测序，得到20个表达序列标签（EST），包括与ATP合成酶β亚基、Rubp羧化酶小亚基同源的EST等，为进一步获得育性转换相关基因和揭示K121S的育性转换分子机制奠定了基础。

2.3 SSH技术在微生物学上的应用

李淼等[9]采用SSH技术寻找副猪嗜血杆菌的毒力基因，以无毒力菌株H465和有毒力菌株SW124为材料，构建了SSH文库，使用Southern杂交和PCR鉴定对差异基因片段进行筛选结果显示，从构建的文库中得到7个特异性差异基因片段，其中，2个差异基因片段与功能未知蛋白基因有关，5个片段分别与膜多糖磷酸酶/糖基转移酶、磷酸核糖甲酰甘氨脒合酶、荚核糖体蛋白丙氨酸、转移酶噬菌体重组蛋白和ABC型硝酸盐，碳酸氢盐/磺酸盐转运系统周质蛋白等编码的基因有同源性。

祝昊丹[10]采用SSH技术将无毒株SH040917SS9与强毒株SH040917进行杂交，共获得61个毒力特异的基因片段，结果表明，这些片段与30种不同的蛋白编码基因具有同源性，包括类枯草杆菌丝氨酸蛋白酶、DNA核酸酶、溶血素相关蛋白酶、苏氨酸磷酸化蛋白酶等。

戴建君[11]采用SSH技术对禽致病性大肠杆菌菌株和人尿源性大肠杆菌差异性表达基因序列进行了相关研究，结果发现了28个新毒力基因片段，并对这些基因片段流行病学进行了调查研究，发现大部分新的毒力基因与流行病学有较大的相关性。

2.4 SSH技术在动物学上的应用

曲宪成等[12]应用SSH技术构建了黄鳝IV期卵巢和间期性腺的差减cDNA文库，正向差减杂交以间期性腺为试验方，IV期卵巢为驱动方；反向差减杂交以IV期卵巢为试验方，间期性腺为驱动方，将获得的差减cDNA片段连接质粒载体，然后转化大肠杆菌DH5α，最后获得的正、反向差减文库分别含461，678个重组子。经PCR扩增鉴定，插入片段范围为200～2 000 bp。随机选取正、反文库共100个阳性克隆测序分析，得到90个有效基因片段，与GenBank进行BLASTx和BLASTn同源比对，进一步从文库中选取2个基因用于半定量RT-PCR，对文库质量进行验证，结果表明，所建文库能够达到富集IV期性腺差异表达基因的目的。黄鳝性腺差减文库的构建，为进一步分离、鉴定黄鳝性腺发育和性逆转的相关基因奠定了基础。

李超等[13]利用SSH技术，以链球菌疫苗免疫前后罗非鱼白细胞cDNA为材料，构建了罗非鱼免疫前后正、负2个cDNA差减文库，并采用地高辛（DIG）标记差减文库cDNA作为探针，进行差异表达片段的筛选鉴定，结果显示，2个文库重组率均在90%以上，插入片段在300～900 bp，接头连接效率超过50%，差减效率非常高，阳性率均超过70%。杂交筛选后，对正、负文库各挑选30个阳性克隆进行测序组装聚类，正、负文库分别获得16，18条EST，所得序列经GenBank同源性分析，正、负文库分别有10，11条EST获得功能注释，且分别有6，7条unigene没有同源性匹配，定为未知新基因。

刘晶等[14]采用SSH技术，研究营养素对皱纹盘鲍基因表达的影响，对构建的文库中48个克隆进行了测序，结果发现了32个已知功能基因和16个新基因。王嘉等[15]采用SSH技术研究皱纹盘鲍Vc缺乏诱导的差异表达基因，共获得了63个基因片段，其中，已知功能基因有34个；在cDNA文库中获得39个片段，其中，已知功能基因有21个，包括细胞代谢、生物调节等相关基因。

另外，梅冰[16]利用SSH技术对溶藻弧菌的毒力相关基因进行筛选和鉴定研究，构建溶藻弧菌毒力菌株SSH文库，结果显示，所构建的溶藻弧菌毒力菌株的SSH文库含有8个已知的常见毒力相关功能基因，该文库还含有166个未知新基因，占文库中总基因数的68.44%，溶藻弧菌的毒力基因很可能存在于这些未知新基因中。说明构建的SSH文库中166个未知新基因很有可能包含有溶藻弧菌的关键毒力基因，为溶藻弧菌毒力基因的鉴定和今后开展溶藻弧菌基因工程疫苗的研制奠定了重要的基础。

3 展望

在现代生命科学研究领域中，差异基因的筛选和鉴定已成为现代分子生物学研究的热点。SSH技术操作简单、所需试验仪器廉价、试验过程简单、阳性率高，分离差异基因提供了一种强有力的工具。随着SSH技术的不断改进，在生物研究的各个领域，如微生物学、动物学、植物学、医学等领域得到了大力的推广。在未来的发展中，SSH将与其他分子生物学技术相结合，各取所长，为研究差异基因的表达提供新的技术手段。

［1］顾克余，翟虎渠.抑制性扣除杂交技术（SSH技术）及其在基因克隆上的研究进展[J].生物技术通报，1999，15（2）：13-16.

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［3］孙守娟，季平，邓诚，等.基于舌鳞癌Tca8113细胞醛脱氢酶活性不同构建差异表达基因cDNA文库[J].第三军医大学学报，2012，34（3）：226-230.

［4］车红花，张明雪，何伟，等.益气活血中药复方对CVB3大鼠心肌细胞感染模型核糖体蛋白L27a表达的影响[J].辽宁中医杂志，2012，39（9）：1862-1864.

［5］李守明，刘昌英，谢国秀，等.应用抑制性消减杂交技术鉴定母鼠铅暴露后代海马差异表达基因[J].中国当代儿科杂志，2010，12（10）：820-824.

［6］刘蕾，徐进，许景升，等.应用抑制性差减杂交法筛选植物青枯菌致病相关基因[J].农业生物技术学报，2012，20（7）：745-755.

［7］闵卓，耿万刚，房玉林，等.应用抑制消减杂交技术筛选葡萄冬芽和夏芽生理休眠相关基因[J].中国农业科学，2014，47（5）：1029-1040.

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［10］祝昊丹.猪链球菌9型毒力基因的筛选及鉴定[D].南京：南京农业大学，2011.

［11］戴建君.禽致病性大肠杆菌IMT5155疑似毒力基因的鉴定及分析[D].南京：南京农业大学，2010.

［12］曲宪成，尚晓莉，程翠，等.黄鳝性腺抑制差减文库的构建和分析[J].中国水产科学，2011，18（1）：23-28.

［13］李超，陈明，李莉萍，等.罗非鱼免疫前后白细胞cDNA差减文库的构建及鉴定[J].西南农业学报，2010，23（4）：1286-1292.

［14］刘晶，张文兵，麦康森，等.皱纹盘鲍外套膜耐维生素E缺乏消减cDNA文库的构建[J].中国水产科学，2007，14（3）：383-389.

［15］王嘉，马洪明，麦康森，等.皱纹盘鲍肝胰腺和肾脏维生素C缺乏诱导的差异表达cDNA文库的构建[J].中国水产科学，2010，17（4）：619-629.

［16］梅冰.溶藻弧菌的分离鉴定及其毒力菌株SSH文库的构建[D].海口：海南大学，2009.

Research Progress on Suppression Subtractive Hybridization（SSH）and Its Application

MEI Bing，LU Xiang，DOU Fa-kai，WANG Hui-lian，LI Xian-qiu，WANG Yong-qiao
（Engineering Center of Energy Saving and Emission Reduction Detection，College of Architecture and Engineering，Yunnan Agricultural University，Kunming650000，China）

Suppression subtractive hybridization is a new technique of differential gene cloning,which has provided powerful technical tools for the study of differential expression of the genes and the molecular cloning of related genes in the process of cell reproduction,development,differentiation,aging and death.This papper briefly outlines the basic principles,advantages and disadvantages of suppression subtractive hybridization and its application in the cloning of related genes.

gene cloning;suppression subtractive hybridization;application

S334

A

1002-2481（2016）02-0271-03

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.02.35

2015-09-16

云南农业大学科研启动基金项目（A1103）

梅冰（1982-），男，湖北武汉人，讲师，博士，主要从事生物质能源研究工作。