中脑星形胶质源性神经营养因子的结构、分泌调控和功能研究进展

王佳，熊辉，骆霞，余绪明

(1湖北医药学院附属人民医院，湖北十堰442000；2武汉大学基础医学院)

中脑星形胶质源性神经营养因子的结构、分泌调控和功能研究进展

王佳1，熊辉1，骆霞1，余绪明2

(1湖北医药学院附属人民医院，湖北十堰442000；2武汉大学基础医学院)

神经营养因子(NTFs)保护神经元免受应激损伤或促进神经元的再生，参与神经元迁移、分化、成熟以及生存。中脑星形胶质源性神经营养因子(MANF)是NTFs家族新成员，结构与典型NTFs不同，由两个结构独立的域构成，即N-末端域(脂激活蛋白样结构域)和C-末端域(SAP结构域)。MANF的分泌受到内质网相关蛋白和Ca2+的调控。MANF不仅具有典型NTFs的功能，而且参与了内质网应激和炎症反应过程。

中脑星形胶质源性神经营养因子；神经营养因子；结构域；脂激活蛋白样结构域；SAP结构域；内质网；钙离子；内质网应激；炎症

神经营养因子(NTFs)是由多种不同结构的胞外信号分子组成。在中央和外周神经系统的发育、功能维持等方面发挥关键作用[1]。中脑星形胶质源性神经营养因子(MANF)是NTFs家族新成员。近年研究发现，MANF具有独特的结构，因而也具有独特的分泌调控机制和功能，相关研究较多。现就MANF的结构、分泌调控和功能研究进展作一综述。

1 MANF的结构

人MANF是一个分泌型蛋白，由21个氨基酸长信号序列连接着128个氨基酸成熟序列构成。蛋白晶体结构分析以及3D结构分析显示MANF蛋白由两个结构独立的域构成，即N-末端域鞘脂激活蛋白(Saposin)样结构域和C-末端SAP结构域。这两个结构域并非紧密的包装在一起，而是作为独立的结构模块由一个相对易弯曲的环状序列串联[3]。

1.1 N-末端Saposin样结构域 MANF的N-末端含有一个典型的闭合环状的Saposin样结构。这个结构由5个α-螺旋(α1～α5)和螺旋α1、α2、α4、α5通过插入α3而形成一个上下4个螺旋束的扭曲拓扑结构。这个结构域在结构上与脂质和膜结合蛋白超家族同源[4]。研究显示MANF的Saposin样结构域表面具有保守的正电荷残基，这有助于它与胞膜之间发生相互作用。文献报道，MANF的N-末端Saposin样结构域可以与特殊的磷脂酶发生相互作用。这与其分子表面存在2个保守的赖氨酸和精氨酸相符[3]。

1.2 C-末端SAP结构域 MANF的C-末端是天然非折叠状态，像还原酶、二硫化物异构酶一样包含一个与二硫键相连的CKGC氨基酸序列。CKGC氨基酸序列是相当重要的，研究发现在这个环内半胱氨酸缺失或改变可以导致MANF生物功能丧失[5]。3D结构分析显示C-末端的结构是由3个螺旋组成。第一个螺旋(α6)以松散形式存在，另两个连续的螺旋(α7和α8)在水平方向上形成一个螺旋-环-螺旋的排布结构。进一步研究发现C-末端SAP结构域与Ku70蛋白的SAP 结构域高度同源[6]。此外，MANF的C-末端SAP结构域和Ku70的C-末端结构域具有相似的抗原表位。细胞研究证实，MANF保护神经元免受凋亡的作用与Ku70一样高效[7,8]。

2 MANF的分泌调控

MANF合成主要通过内质网上的核糖体。MANF并非是一个典型的分泌型生长因子，这是因为它的大多数蛋白主要定位于内质网腔，仅有少部分以分泌形式出现[9, 10]。前期研究表明MANF蛋白90%表达于内质网上，这与其他NTFs不同。其他NTFs主要是通过内质网和高尔基体分泌[3]。

MANF的分泌受到它的N-末端和C-末端序列的影响。前21个氨基酸残基作为一个信号肽发挥功能，在蛋白质合成期间介导MANF直接定位于内质网，并且允许其进入分泌途径[11]。在人源的MANF的C-末端包含了一个假定的内质网驻留信号序列即RTDL序列。它与典型的内质网驻留信号KDEL相似。C-末端的RTDL序列是MANF定位的关键，删除RTDL序列则MANF的分泌增加。此外，在人源蛋白质中，MANF是惟一包含了4类C-末端氨基酸的蛋白。研究显示，KDEL与内质网蛋白驻留受体之间发生相互作用可以调控MANF的运输和分泌[12]。

另一些研究则认为内质网驻留蛋白MANF分泌的调控是由双重机制介导，一是由内质网蛋白驻留受体介导；二是在Ca2+介导下结合到GRP78上[13]。

3 MANF的功能

3.1 神经营养功能 MANF可在体外促进胚胎的多巴胺能神经元的存活[14,15]。近期的研究表明，重组的人源MANF剂量依赖性的增加了胰岛β细胞的增殖[16]。而且在MANF敲除的小鼠中，它被认为是胰腺β细胞存活所必须。胰岛细胞内MANF表达缺失将导致严重的糖尿病[16]。脑局部缺血和心肌局部缺血可以诱导MANF的表达和分泌，并且细胞外的MANF以自分泌或旁分泌的方式保护神经元和心肌细胞而对抗凋亡作用[17～19]。Yang等[18]报道了大鼠脑缺血模型中MANF是上调的，MANF可保护细胞免受缺血损伤。同时发现MANF对瞬时脑缺血有保护作用，MANF显著减小了脑梗死的大小面积并且也改善了中风大鼠的行为。此外其还发现MANF可抑制海马和额叶内因脑缺血引起的神经元丢失。

另一些研究显示MANF过表达改善了小脑萎缩症(SCA17)小鼠模型中突变的TATA盒结合蛋白(TBP)介导的浦肯野细胞退行性变[19,20]。Zhao等[21]报道了MANF可以衰减缺氧缺糖诱导的星形胶质细胞的损伤而且提高了细胞存活能力。Petrova等[15]报道了MANF促进了大鼠胚胎期黑质多巴胺能神经元的存活，而不是5-羟色胺能或γ-氨基丁酸(GABA)能神经元的存活。此外，纹状体内注射MANF重组体可以保护多巴胺能神经元免受6-OHDA诱导的神经退行性病变损伤[22]。脑缺血和癫痫损伤的大脑皮层内MANF的转录和蛋白水平均是上调的，暗示它可能发挥神经保护作用以对抗神经毒性和脑缺血损伤[11, 19, 22～24]。

3.2 参与内质网应激(ERS) 尽管MANF是一个分泌蛋白，但它并非是一个典型的分泌型生长因子，这是因为它大多数位于内质网腔，仅有少部分的分泌[9, 10]。众多研究表明，MANF在体内或体外可以保护细胞免受ERS诱导的细胞死亡[25]。其晶体结构表明，在内质网中，MANF可以帮助蛋白折叠，即MANF的C-末端结构域包含的127CKGC130模体内含有两个半胱氨酸形成的C-末端二硫化物网桥，这一结构可能在内质网中促进了半胱氨酸网桥的形成以及蛋白质的折叠，如此一来降低了由非折叠或错误折叠蛋白引起的ERS[26]，继而预防多种由ERS引起的疾病，如神经退行性疾病、遗传性小脑萎缩和共济失调、2型糖尿病和糖尿病性肾病、心血管疾病如心肌萎缩、心衰、缺血性心脏疾病以及动脉粥样硬化[27]。

研究表明ERS反过来可以激活非折叠蛋白反应(UPR)。UPR的活化通过三个信号级联，即借助内质网跨膜敏感蛋白PERK、IRE1和ATF6。这三个蛋白在正常细胞中通过结合到内质网主要伴侣分子GRP78/Bip上维持着失活状态。当ERS时，GRP78与敏感蛋白分离并且随后被活化[27]。研究显示，在UPR中，MANF是ATF6α、ATF6β、sXBP1的下游靶基因，并且与内质网常驻伴侣分子一同被诱导，甚至与促凋亡因子如生长停滞及DNA损伤可诱导基因153(GADD153)一同被诱导[14]。

对MANF的基因分析发现其启动子区域内存在一个Ⅱ型ERS反应元件(ERSRE Ⅱ)[28]。ERS反应相关的6个转录因子即ATF6α、ATF6β、Luman、OASIS、sXBP1和uXBP1均可通过ERSRE Ⅱ来调控小鼠MANF基因的启动子活性，其中ATF6α的调控作用最强，ATF6β和sXBP1作用相对适中。有趣的是，在Neuro2a细胞内过表达的Luman或OASIS并不增强ERSRE Ⅱ依赖的MANF启动子活性[28]。因此ERS可以调控MANF的表达。此外众多研究显示，在ERS中MANF是上调的，如在Hela细胞中各种ERS诱导物作用导致MANF蛋白表达上调，内源性MANF敲低后加剧了ERS诱导的细胞死亡[9]。野生型果蝇的DmMANF发生突变，结果出现长期的ERS和PERK的磷酸化增加[25]。Tadimalla等[29]研究发现，在心肌缺血再灌注在体模型中ATF6的活化减少了缺血损伤，并且诱导了MANF基因的表达，进一步发现，体外培养的心肌细胞模拟缺血实验结果诱导了MANF的表达，而且这种诱导作用是以ATF6依赖的方式产生。此外，研究显示MANF是CRELD2分泌的一个关键调控因子。前期研究证实CRELD2是一个新型的ERS诱导蛋白。细胞内的MANF似乎增加了CRELD2的分泌，过表达的MANF正向调控了CRELD2的分泌[30]。

3.3 参与炎症 炎症可以引起ERS并且因此活化了非折叠蛋白反应(UPR)。ERS反应以及随后的UPR激活NF-κB。NF-κB是一个很重要的转录调控子，在炎症的开始阶段(伴随着IκB的降解)起着关键的调控作用[31]。UPR信号通路和NF-κB之间的相互联系是依赖UPR的全部三个分支。这包括以下几点：一是定位于内质网的IRE1α是NF-κB活化所必须，其机制是通过TRAF2介导IRE1α和IκK之间形成复合体，这导致IκB的降解。二是激活PERK-eIF2α引起IκBα翻译的抑制，这导致IκB蛋白水平降低并且随后导致NF-κB和IκB的比例增加，这个比例的变化导致NF-κB释放增加，随后进入胞核发挥促炎调控作用。三是ATF6可以激活NF-κB。葡萄糖损耗可通过SubAB(一种选择性降解Grp78的蛋白酶)来调控ERS蛋白Grp78(Bip)，这一过程导致Akt的瞬时磷酸化并且随后通过ATF6来激活NF-κB[32]。实验表明自身免疫性疾病以及炎症疾病模型中，ERS诱导了MANF的上调。如风湿性关节炎(RA)和系统性红斑狼疮(SLE)患者体内的外周白细胞(PWBC)中MANF较正常人其表达显著上调。抗原诱导关节炎模型的成纤维细胞样滑膜细胞(FLS)中MANF的诱导表达，结果发现MANF主要位于胞质和胞核，且在FLS细胞中炎症和ERS可以诱导MANF重定位于胞核。进一步研究发现在炎症或ERS条件下细胞核内的MANF通过它C-末端SAP样结构域与p65的DNA结合域之间发生相互作用，结果MANF通过干扰p65与它的靶基因启动子之间的结合而抑制了p65介导的转录激活效应。实验还发现MANF抑制了TNFα触发的NF-κB 的激活效应且MANF的C-末端SAP样结构域在其抑制NF-κB 信号中发挥关键作用[33]。

另一些研究发现，缺氧缺糖诱导大鼠原代培养的星型胶质细胞的损伤模型中MANF上调了伴侣分子GRP78且显著降低了缺氧缺糖诱导的NF-κB p65表达。此外，MANF显著抑制了缺氧缺糖诱导的IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎因子的表达及分泌。这些研究表明MANF通过抑制ERS，减轻细胞的损伤和炎症反应，提示MANF在中枢神经系统的神经保护中具有广阔的应用前景[21]。Zhu等[33]报道了MANF通过调控NF-κB和p38的磷酸化，结果导致细菌脂多糖(LPS)诱导的IL-1β、TNF-α和IFN-γ等促炎因子表达水平的降低。

尽管MANF可能是炎症的一个负向调控子并且介导NF-κB通路和ERS之间的交互作用。然而前期的一些报道显示，早期阶段，ERS和随后的UPR诱导了一个快速且适中的NF-κB的激活反应，接着在此后的阶段，持续的UPR可以抑制NF-κB的激活[32]。

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余绪明(E-mial: 836038696@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.47.035

R318.08;Q813

A

1002-266X(2016)47-0110-04

2018-08-12)