氧化应激及H2O2对动物细胞凋亡的影响

韩奇鹏，罗　玲，揭红东，周传社，张佩华*

（1.湖南农业大学动物科学技术学院畜禽遗传改良湖南省重点实验室，长沙　410128；2.中国科学院亚热带农业生态研究所亚热带农业生态过程重点实验室，湖南省畜禽健康养殖工程技术中心，农业部中南动物营养与饲料科学观测实验站，长沙　410125）



氧化应激及H2O2对动物细胞凋亡的影响

韩奇鹏1, 2，罗玲1，揭红东1，周传社2，张佩华1*

（1.湖南农业大学动物科学技术学院畜禽遗传改良湖南省重点实验室，长沙410128；2.中国科学院亚热带农业生态研究所亚热带农业生态过程重点实验室，湖南省畜禽健康养殖工程技术中心，农业部中南动物营养与饲料科学观测实验站，长沙410125）

摘要：氧化应激是断奶家畜机体损伤的重要原因之一，文章对氧化应激的概念、机制、内外因素和H2O2对动物细胞凋亡损伤模型的研究与应用等方面作以综述。

关键词：氧化应激；H2O2；动物细胞凋亡

氧化应激（OS）是断奶家畜常见的机体应激状态，是使断奶家畜生产遭受损失的重大原因之一[1]。近年来，我国畜牧业集约化程度不断提高，但由于断奶家畜生理发育的特点及营养、心理、环境等因素的综合作用，常伴随强烈的应激反应，如精神萎靡、腹泻、采食量下降等[2-3]。家畜断奶后采食量的迅速下降再上升，胃肠道血流量大量减少后不断升高，从而造成胃肠道出现“缺血再灌注”的现象，产生大量H2O2，H2O2通过Fenton和Haber-weiss反应产生大量氧自由基，对组织细胞造成氧化损伤[4-7]。同时日粮中多饱和脂肪酸含量过高、矿物元素缺乏（硒、锌、锰等）、环境冷热变化、电离辐射、药物和疫苗大量使用等，都会造成组织细胞内抗氧化防御系统受损，使断奶家畜处于氧化应激状态[8]。

动物机体细胞膜性结构上的多不饱和脂肪酸被自由基氧化，使膜性结构受损，提高细胞膜的通透性，进而破坏细胞内蛋白质和核酸，降低抗氧化酶活性，损伤细胞正常功能，使组织功能运转异常，降低机体免疫力，为疾病的产生提供可能。氧化应激初期会引起代谢性疾病，具体表现为采食量降低，进而料肉比、生产性能降低等；动物机体长期处于应激状态，机体为维持体内氧化和抗氧化系统的动态平衡，消除大量自由基，抗氧化物质或抗氧化物酶合成前体物质（维生素、氨基酸等其他微量元素）被大量消耗。如果机体自由基不断增加，而抗氧化物质或抗氧化物酶合成前体物质得不到及时补充，家畜机体氧化与抗氧化系统稳态被破坏，使家畜机体发育受损，疾病抵抗能力降低、生产性能降低，导致畜牧业遭受极大的损失[9]。

1 氧化应激

20世纪90年代美国Sohal提出氧化应激是机体受到刺激后，体内产生的活性氧自由基（ROS）和活性氮自由基（RNS）增多或清除能力下降，造成体内氧化系统紊乱。当活性氧/氮自由基的增长量机体无能力清除时，则引起细胞和组织生理或病理反应。正常生理状态下，人体每天产生的ROS或RNS相对分子质量分别为2.5×1011或40×1021，共同构成清除体内毒素、消灭体内外来细菌、病原体及产生能量的重要因素，且能调节内分泌、代谢系统，还是神经信号和转录因子的调节信使，参与体内多种生命活动的调节，是机体不可缺少的调节因子，为生物进化提供保证[10]。但氧化自由基包括与自身免疫病、肿瘤、炎症以及细胞程序化死亡等多种过程密切相关的超氧化物、H2O2、氢氧基等[11-12]。如果产生量超过机体的清除量，则会直接或间接损伤DNA，诱导基因突变，导致蛋白质表达出现异常和脂质过氧化，使机体衰老或病变[13-14]。机体为有效抵抗过氧化损伤，在进化过程中形成抗氧化系统，包括酶类抗氧化物质和非酶抗氧化物质。酶类抗氧化物质有谷胱甘肽过氧化物酶、硫氧还原蛋白、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶等；非酶类抗氧化物质有类胡萝卜素、抗坏血酸、维生素E和生育酚等。因此，机体内氧化和抗氧化系统动态平衡反映了细胞结构和功能的正常状态。

研究表明，自由基的过多产生和氧化应激的发生会导致肝脏发生氧化损伤[15]。氧自由基是活性氧ROS及其衍生物等是氧化反应中的重要成分，在缺血再灌注损伤中起重要作用，可诱导肾小管上皮细胞凋亡[16]。

2 氧化应激的内外因素

2.1 内因

正常生理状态下，每个细胞每天产生约1×1011个活性氧分子，其主要来源有：需氧细胞代谢时产生的副产物，主要有超氧阴离子、氢氧根离子和超氧阳离子等；细胞色素P450进行细胞解毒时产生的活性氧；不饱和脂肪酸等大分子物质降解时的副产物。因此，当机体抗氧化能力降低或体内产生过量的活性氧时，会导致凋亡的细胞增加[17-19]。

2.2 外因

H2O2是一种重要的外源性活性氧，其可氧化细胞膜上的蛋白质和脂肪，通过自由扩散的形式穿过细胞膜与细胞内化合物反应生成·OH等活性强的自由基，再与细胞膜中不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，其代谢产物破坏细胞膜的结构与功能，导致细胞凋亡，其损伤程度取决与细胞的种类、密度、H2O2的浓度和作用时间[20]。H2O2有两种方式生成氧化反应的自由基，通过铁离子（Fe2+）或铜离子（Cu2 +）作用生成OH-；自身均裂产生OH-。因此，很多体外研究氧化应激损伤的模型以H2O2为外源活性氧[21-23]。

3 氧化应激诱导细胞凋亡的机制

氧化应激诱导细胞凋亡机制主要分为4类：机体大量的活性氧可直接损伤DNA，活化转录调节因子p53，p53可诱使Fas和TNF-α从内质网中释放，激活Caspase，诱导细胞凋亡；活性氧分子攻击生物膜多不饱和脂肪酸，使细胞膜及亚细胞膜发生脂质过氧化，导致细胞和组织裂解、相关酶和氧化强化剂的释放，导致信号传导系统紊乱，激活相关凋亡基因，促使细胞凋亡；线粒体呼吸链产生大量的活性氧，导致线粒体通透性变大，释放出线粒体膜间隙的调节凋亡蛋白（Bcl-2）或减少线粒体内基因组与转录相关的mRNA、rRNA和DNA的降解极低表达，激活线粒体凋亡通路，诱导细胞凋亡；活性氧刺激可解除抑制蛋白的负调控，使抑制蛋白与核转录因子-κB（NF-κB）分离，致使核转录因子-κB（NF-κB）获得活性及大量表达，通过与凋亡相关的DNA相互作用，激活p53引发细胞凋亡或通过激活c-jun N-末端激酶并联合p38通路介导细胞凋亡[24-30]。

4 H2O2对动物细胞凋亡损伤的研究进展与应用

有研究者认为，H2O2可通过调节Bcl-2、Bax，Caspase等蛋白表达，诱导细胞的凋亡。罗元一等研究发现，H2O2抑制凋亡抑制基因Bcl-2的表达及促进Caspase-3表达，最终发挥促凋亡作用[31]。黄小芳等采用H2O2研究心肌细胞凋亡机制，结果发现，H2O2使心肌细胞中Bcl-2表达减少，Bax表达增加，促使Bcl-2与Bax基因比率降低，进而诱导细胞凋亡[32]。还有研究表明，H2O2可促进Caspase-3、Bax蛋白的表达及抑制Bcl-2蛋白的表达，增加加Bax蛋白的同源性结合，激活Caspase凋亡通路，诱导细胞凋亡[33]。赵宏宇等研究表明，H2O2可下调Bcl-2蛋白在血管内皮细胞内的表达，进而引起细胞凋亡[34]。由于Bcl-2基因是一种原癌基因，可以抑制由多种细胞毒因素所引起的细胞死亡。其抑制细胞凋亡机制可能与以下几种作用有关：细胞抗氧化作用、抑制钙离子跨膜流动、具有离子通道和吸附蛋白双重功能[35]。Bcl-2家族虽然并不是决定细胞凋亡的唯一因素，但是这些蛋白的翻译后修饰对凋亡的调节有重要影响。Park等采用H2O2作用于成骨细胞，发现H2O2能够激活MAPK/ ERK信号转导通路并影响下游通路，诱导Bax基因表达上调，细胞增值抑制，分化受限，甚至引起细胞凋亡[36]。李跃艳等研究表明，H2O2刺激人脐静脉内皮细胞（HUVEC）内PTEN的表达，抑制PI3K/ Akt信号通路的激活，Akt是主要抗凋亡通路，持续抑制Akt不但能促进PTEN介导的凋亡，还能通过抑制其下游靶蛋白（Bcl-2等）促进凋亡分子的表达，来诱导细胞凋亡[37]。

H2O2是ROS其中之一，穿过细胞膜后，与细胞内Fe2+进行Fenton反应，形成活性较高的自由基(·OH)，进而引起一系列反应。H2O2具有获得容易、性质稳定和操作简单等特点，因此目前H2O2是各类细胞氧化损伤模型中应用最为广泛的应激源之一[38]。建立在细胞半抑制的基础上，并以H2O2为刺激源诱导细胞氧化应激建立模型的方法多应用于医学领域，如体外培养的心肌细胞、肝脏细胞，而关于建立山羊瘤胃上皮细胞氧化应激损伤模型的研究少有报道[39]。Wei等研究表明，细胞死亡率为25%时，可作为建立H2O2氧化诱导鼠嗜铬细胞瘤氧化损伤模型的判别标准[40]。Huo等建立小鼠的心肌细胞氧化损伤模型，发现细胞存活率为40%～50%，可作为H2O2氧化损伤模型的依据[41]。周丽娜等研究表明，细胞死亡率为20%～30%可作为建立小鼠脊髓神经元细胞氧化应激模型的依据[42]。孙蜻陶等研究表明，以细胞死亡率为50%～60%作为建立延边奶山羊BMEC氧化损伤模型的判别标准[43]。通过上述分析，建立不同种类细胞氧化损伤模型的H2O2作用浓度与作用时间差异很大，可能由于不同细胞对氧化损伤的耐受能力不同。但细胞存活率过高或过低，都不利于后续氧化应激机制的研究[44]。因此，细胞损伤程度及氧化应激指标的变化趋势是建立细胞氧化损伤模型的关键。

可能是高浓度的H2O2能通过活化山羊瘤胃上皮细胞内的iNOS，促进NO下降；或是由于H2O2会启动脂质过氧化反应的发生，进而产生更多的自由基，造成机体抗氧化能力的下降，导致氧化和抗氧化的不平衡；此外，细胞内大量的自由基会破坏了细胞膜，加速蛋白质的分解，影响氧化酶或抗氧化酶的活性，进而导致抗氧化能力的降低；同时机体自身保护效应降低了抗氧化酶活力，进而引起细胞氧化损伤，导致细胞的凋亡[45-46]。

5 结　论

随着畜牧业集约化生产和动物保健意识的不断增强，研究人员对一些实际生产问题有了深入认识。氧化应激是危害断奶幼畜的问题之一，造成断奶家畜的精神萎靡、腹泻、采食量下降等与氧化应激损伤有关的疾病。因此，了解氧化应激的概念、机制、内外因素作用的机理等，可以更好应用营养物质（家畜机体外源性抗氧化活性物质包括：维生素E、维生素C、硒、镁、谷胱甘肽、谷氨酞胺及活性物质二氢杨梅素和茶多酚等）来缓解氧化应激[47-48]。维持或提高家畜机体正常生理功能来解决氧化应激对断奶家畜机体的损伤，为断奶家畜健康成长提供保障，进而促进畜牧业健康可持续发展。

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Effects of Oxidative Stress and H2O2on Apoptosis of Animal Cells

HAN Qipeng1,2, LUO Ling1, JIE Hongdong1, ZHOU Chuanshe2, ZHANG Peihua1*
（1.Hunan Provincial Key Laboratory for Genetic Improvement of Domestic Animal, College of Animal Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, Hunan China; 2.Key Laboratory for Agro-ecological Processes in Subtropical Region, Institute of Subtropical Agriculture, Chinese Academy of Science, Hunan Research Center of Livestock & Poultry Sciences, South-Central Experimental Station of Animal Nutrition and Feed Science of Ministry of Agriculture, Changsha 410125, Hunan China）

Abstract:Oxidative stress is one of the important causes of weaner animal body injury.This article reviewed the concept of oxidative stress, mechanism, internal and external factors and research and application aspects of apoptosis model by H2O2on animal cell.

Key words:oxidative stress; H2O2; animal cells apoptosis

中图分类号：Q505；Q255

文献标志码：A

文章编号：1001-0084（2016）05-0008-04

收稿日期：2016-03-08

作者简介：韩奇鹏（1988-），男，内蒙古赤峰人，硕士研究生，研究方向为反刍动物营养。

*通讯作者：副教授，硕士生导师，Email: peiqin41-@163.com。