PCR反向点杂交技术快速鉴定BALF中分枝杆菌菌种的应用研究

辛茶香，熊国亮，袁小兰，张周云，彭亦平

（江西省胸科医院，江西 南昌330006）

PCR反向点杂交技术快速鉴定BALF中分枝杆菌菌种的应用研究

辛茶香，熊国亮，袁小兰，张周云，彭亦平

（江西省胸科医院，江西 南昌330006）

目的 探讨PCR-反向点杂交技术 （PCR-RDBHA）快速鉴定支气管肺泡灌洗液 （bronchoalveolar lavage fluid BALF）标本中分枝杆菌菌种的临床应用价值。方法对临床306例活动性肺结核患者、疑似非结核分枝杆菌感染肺病患者BALF标本采用PCR-反向点杂交技术和传统的改良罗氏培养法进行分枝杆菌菌种鉴定。结果306例BALF标本PCR反向点杂交技术检测出分枝杆菌127例，阳性率为41.5%（127/306），其中结核分枝杆菌复合群（MTC）108例，占分枝杆菌的85. 0%（108/127），非结核分枝杆菌（NTM）19例，占分枝杆菌的15.0%（19/127）。NTM中，6例脓肿分枝杆菌，10例胞内分枝杆菌，2例戈登分枝杆菌，1例瘰疬分枝杆菌；传统的改良罗氏培养法检测出分枝杆菌101例，阳性率33.0%（101/306），经菌种的初步鉴定，其中MTC89例，占分枝杆菌的88.1%（89/101），NTM12例，占分枝杆的11.9%（12/101）。结论PCR反向点杂交技术能够快速鉴定BALF中分枝杆菌菌种，该方法简便、结果准确，具有良好的临床应用价值。

分枝杆菌；菌种鉴定；聚合酶链反应；反向点杂交

分枝杆菌属包括结核分枝杆菌复合群（Mycobacterium tubetculosis comples，MTC）和非结核分枝杆菌（Nontuberculous mycobacterium，NTM）。近年来，由于HIV传播的日益猖獗，作为机会性感染之一，非结核分枝杆菌感染率不断在上升［1］。由于其对不同抗菌药物敏感性不同，这两类分枝杆菌感染后的治疗方案存在很大差别，因此二者的鉴别具有重要的临床意义［2］。目前，常规的分枝杆菌菌种鉴定需采用分枝杆菌培养分离株在进行抗结核药物的药敏试验时，将菌种接种于含对硝基苯甲酸（PNB）和噻吩-2-羧酸酰肼（TCH）鉴别培养基上，并辅以硝酸还原试验、烟酸试验和耐68℃热触酶试验，初步鉴定为结核分枝杆菌、牛分枝杆菌或NTM。该方法耗时较长，操作繁琐，污染大，缺乏可重复性，难以满足临床诊断和治疗的需要［3，4］。本研究以分枝杆菌rpoB基因为靶基因序列，应用聚合酶链反应反向点杂交技术快速鉴定患者BALF中分枝杆菌菌种，结果报告如下。

1　材料与方法

1.1标本来源 306例肺结核或疑似肺部NTM感染者均是2014年8月至2015年12月在江西省胸科医院住院的患者，其中男205例、女101例；年龄22～80岁，平均年龄47.3岁。所有患者均符合结核病的诊断标准［5］，或非结核分枝杆菌病的诊断标准［6］。支气管肺泡灌洗液（BALF）的留取：由临床医师通过3300型电子纤维支气管镜，向肺内灌入无菌生理盐水，反复多次回收灌洗液约20～30ml，分两管送检。

1.2仪器和试剂DA7600 DNA扩增仪由中山达安公司提供；YN-H16恒温杂交仪和PCR扩增试剂、杂交试剂由深圳亚能生物技术有限公司提供；改良罗氏培养基和PNB、TCH鉴别培养基由江西省胸科医院检验科自配。

1.3方法

1.3.1PCR-反向点杂交技术⑴支气管肺泡灌洗液的处理，若灌洗液中含有痰或血（不含痰或血的肺泡灌洗液直接离心），则需加入一定量的4%氢氧化钠进行液化20min，经4000r/min离心20min，弃上清液，取离心后的灌洗液1.2ml到1.5ml的离心管中，12000r/min，离心5min，弃上清液，向沉淀液中加入1ml洗液，充分混匀，12000r/min，离心5min，弃上清液（含血标本应增加一次洗涤）。向沉淀中加入50μl裂解液，充分混匀，沸水浴10min，12000r/min，离心2min，留上清液备PCR扩增用。⑵PCR扩增引物：以分枝杆菌rpoB基因为靶基因序列设计扩增引物，上游引物5'-GAAGGTGGGAT CGGCGA-3'，下游引物5'-CCATGCGCCCTTAAA CACT-3'；扩增382bpDNA片段。⑶PCR扩增条件：①50℃，2min→95℃，10min；②95℃，45s→←64℃，60s，20cycles；③95℃，30s→←56℃，30s→←68℃，45s，30cycles；④68℃，5min。⑷PCR模板加样、扩增、杂交、洗膜和显色严格参照说明书进行操作。⑸结果观察：阳性质控品正常显色，膜条上每个位点对应一种分枝杆菌，当该点有信号说明为相应的分枝杆菌。

1.3.2传统的改良罗氏培养法菌种初步鉴定⑴取另外一管液化和离心好的肺泡灌洗液400μl接种于酸性改良罗氏培养基的斜面上，注意覆盖整个斜面，每份标本接种二管培养基。于37℃培养，每周观察一次生长情况，若长出可见的典型菌落者为分枝杆菌生长阳性，可疑菌落用抗酸染色进行鉴定是否为分枝杆菌菌落，接种8周未见菌落判为阴性结果。⑵取酸性罗氏培养基上的生长菌落，于吐温生理盐水中磨成菌液，分别接种到含对硝基苯甲酸（PNB）和含噻吩-2-羧酸肼（TCH）的中性罗氏培养基上，同时接种一管没有加药的中性罗氏培养基作对照管，于37℃培养4周观察生长情况。⑶结果判断：在对照管中有分枝杆菌生长情况下，若PNB和TCH培养基上都不生长则为牛分枝杆菌；若PNB管不生长、TCH管生长则为结核分枝杆菌；若PNB和TCH管都生长则为非结核分枝杆菌。经上述试验可以将分枝杆菌初步鉴定为结核分枝杆菌群和非结核分枝杆菌（NTM）［7］。

1.3.3PCR-DNA测序 ⑴对部分PCR反向点杂交鉴定为NTM的BALFDNA裂解产物再次进行PCR-DNA测序扩增，将扩增产物纯化送上海生工生物工程有限公司进行测序。⑵测序引物及扩增片段：根据分枝杆菌16S-23SrDNA转录间隔区序列设计引物。上游引物5'-GAAGTCGTAACAAGG TAGCCG-3'；下游引物5'-GATGCTCGCAACCAC TATCTA-3'，分别位于上游16SrDNA的末端和16S-23SrDNAITS序列保守区。扩增出目的片段，结核分枝杆菌扩增产生265bp片段，NTM产生约260～350bp不等的片段。⑶序列分析，测序结果经DNAStar软件拼接后，分别在NCBI GenBank数据库进行序列同源性比较分析，以鉴定菌种。

2　结果

2.1306例肺泡灌洗液标本PCR反向点杂交技术结果检测出分枝杆菌127例，阳性率为41.5% （127/306），其中结核分枝杆菌群108例，占85.0% （108/127）；非结核分枝杆菌19例，占15.0%（19/ 127）。NTM中，6例脓肿分枝杆菌，10例胞内分枝杆菌，2例戈登分枝杆菌，1例瘰疬分枝杆菌。

2.2传统的改良罗氏培养法菌种初步鉴定结果检测出分枝杆菌101例，阳性率33.0%（101/306），其中结核分枝杆菌群89例，占88.1%（89/101），非结核分枝杆菌12例，占11.9%（12/101）。但没能将12例NTM鉴定到种。

2.3306例肺泡灌洗液标本在传统的改良罗氏培养法结果 菌种初步鉴定出的89例结核分枝杆菌和12例非结核分枝杆菌，经PCR-反向点杂交技术平行检测全部检测为阳性，且全部相符。

2.4PCR-DNA测序结果取4份经PCR-反向点杂交技术鉴定为脓肿分枝杆菌（2例），胞内分枝杆菌 （2例）的BALFDNA裂解产物经扩增后进行DNA测序，PCR-反向点杂交技术和PCR-DNA测序两者鉴定结果一致。

3　讨论

近年来，以PCR为基础的各种分子检测技术的发展，为分枝杆菌菌种鉴定提供了新的技术手段［8，9］。PCR-反向点杂交技术是近几年来建立的一种快速鉴定分枝杆菌菌种的新方法，该技术的原理是以分枝杆菌rpoB基因编码序列为靶基因，设计特异的PCR引物且其5'端用生物素进行标记，扩增获得一定长度的分枝杆菌基因片段，该片段包含了所要检测的所有分枝杆菌菌种类型。根据不同分枝杆菌之间的差异，按照碱基互补配对原则，设计特异性识别某种分枝杆菌序列的寡核酸探针。探针5'端用氨基标记，通过化学键作用固定在硝酸纤维膜上，制成包含探针陈列的膜条。将带有生物素标记的PCR扩增产物与膜条上的探针进行分子杂交，再通过显色，观察膜条特定位置显色，从而鉴定该分枝杆菌的种类［10］。该技术可以鉴定出结核分枝杆菌复合群、耻垢分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、龟分枝杆菌、海分枝杆菌、偶发分枝杆菌、土分枝杆菌、不产色分枝杆菌、鸟分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、戈登分枝杆菌等23种分枝杆菌。

对痰少或无痰的患者留取BALF较为合适，但是临床医师在留取BALF时要注意患者的耐受能力。本研究应用PCR-反向点杂交技术直接对306例患者BALF中的分枝杆菌进行了菌种鉴定，其中鉴定出19例NTM，占所有检出分枝杆菌的15.0% （19/127），高于传统的改良罗氏培养法鉴定的11.9%（12/101），但低于2010年第五次全国结核病流行病学调查的22.9%［11］。PCR-反向点杂交技术比传统的改良罗氏培养法检测出的分枝杆菌例数和NTM例数要高，其原因可能是：⑴PCR扩增的灵敏度比传统的改良罗氏培养法高，PCR扩增对死和活的分枝杆菌都可以扩增出阳性结果，但培养只能培养活的分枝杆菌；⑵检测技术的差别，在改良罗氏培养法中采用的是传统PNB和TCH鉴别培养基，某些NTM菌株在PNB培养基的生长实验结果可能为阴性［12］。

随着艾滋病的流行NTM的发病率呈上升趋势［13，14］，在306例患者中有部分是艾滋病并发肺部感染者，这是导致本研究NTM高于张晓娟报道的8.7%的原因［15］。

本研究以PCR-DNA测序为对照，2例脓肿分枝杆菌、2例胞内分枝杆菌的BALFDNA裂解产物经扩增后进行DNA测序与PCR-反向点杂交鉴定结果一致，但与标本量相比DNA测序的例数还应增加，来进一步验证PCR-反向点杂交技术的准确性。

传统的改良罗氏培养法鉴定菌种只能初步鉴定为结核分枝杆菌、牛分枝杆菌和NTM，且时间需要2～3个月左右，在操作研磨菌种时对工作人员具有很大的危害性。而PCR反向点杂交技术可以鉴定出23种分枝杆菌，整个检测时间只需要6h，操作过程不存在研磨菌种，生物安全性好；但分枝杆菌属共有250多种菌种［10］，若样本中存在本检测范围23种外的NTM就不能检出，同时该技术最小检出菌量为105cfu/ml，这是该技术检测的局限性。

综上所述，PCR反向点杂交技术能够快速鉴定BALF中分枝杆菌菌种，该方法简便、且结果准确，具有良好的临床应用价值。

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The application research of PCR-reverse dot blot hybridization assay for rapid identification of Mycobacterium species in BALF

XIN Chaxiang，XIONG Guoliang，YUAN Xiaolan，ZHANG Zhouyun，PENG Yiping.Jiangxi Provincial Chest Hospital，Nanchang 330006，China.

Objective To identify Mycobacterium species in BALF rapidly by polymerase chain reaction-reverse dot blot hybridization assay（PCR-RDBHA）.Methods 306 cases of BALF from pulmonary tuberculosis patients and nontuberculous Mycobacteria（NTM）lung diseases patients were collected，Mycobacterium species of 360 cases of BALF were simultaneously detected by PCR-RDBHA and Roche medium culture.Results The positive rates of detecting Mycobacterium by PCR-RDBHA were 41. 5%（127/306），108 cases（85.0%）were determind to be M.tuberculosis comples（MTC），19 cases were determind（15.0%）to be NTM which contained 6 cases of M.abscessus，10 cases.of M.intracellulare，2 cases of M.gordonae and 1case of M.scrofulaceum.The positive rates of detecting mycobacterium by culture were 33.0%（101/306），89 cases（88.1%）were determined to be M.tuberculosis comples（MTC），12 cases were determined（11.9%）to be NTM.Conclusion PCR reverse dot blot hybridization technique can quickly identify mycobacterium species in BALF.The method is simple and accurate，and has good clinical application value.

Mycobacterium；Species identification；Polymerase chain reaction；Reverse dot blot hybridization assay

R378.91，R446.62

A

1674-1129（2016）04-0439-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2016.04.009

江西省卫生计生委科技计划项目（编号：20165519）

辛茶香，女，1969年8月生，本科，副主任技师，主要从事结核病的细菌学、免疫学、分子生物学检验和研究工作。

（2016-04-29；

2016-07-07）