瓣膜性心房颤动患者心房结构重塑特征分析的多中心研究

潘军强，张殿新，寿锡凌，周 鑫，孙超峰

(1. 陕西省人民医院心内二科，陕西西安 710068；2.第四军医大学附属西京医院心血管内科，陕西西安 710032；3. 西安交通大学第一附属医院心血管内科，陕西西安 710061)



瓣膜性心房颤动患者心房结构重塑特征分析的多中心研究

潘军强1，张殿新2，寿锡凌1，周 鑫3，孙超峰3

(1. 陕西省人民医院心内二科，陕西西安 710068；2.第四军医大学附属西京医院心血管内科，陕西西安 710032；3. 西安交通大学第一附属医院心血管内科，陕西西安 710061)

目的 在人体组织学水平观察瓣膜性心房颤动患者心房结构重塑的特点。方法 选取西安交通大学医学部第一附属医院、西京医院、陕西省人民医院心脏外科因风湿性心脏瓣膜病住院并行瓣膜置换手术的患者84例，其中心房颤动组39例，窦性心律组45例。收集整理患者的临床资料，并于手术中获取右心房组织(0.3～0.5 mm3)。HE染色、Masson染色观察两组患者右心房纤维化程度；RT-qPCR技术测定心房组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达。结果 两组患者在性别构成比、年龄、血压、血常规、生化指标等方面经统计学分析，差异无统计学意义(P>0.05)；心房颤动组左、右心房直径明显大于窦性心律组(P<0.05)；HE染色、Masson染色结果提示心房颤动组心房组织存在明显纤维化，心房颤动组胶原容积分数显著高于窦性心律组(45.37±2.33vs. 12.90±1.02，P<0.05)；心房颤动患者心房组织中Ⅰ型胶原mRNA表达明显高于窦性心律组(2.042±0.177vs. 0.988±0.099，P<0.05)，而Ⅲ型胶原mRNA的表达较窦性心律组高，但组间比较差异无统计学意义(1.228±0.151vs. 1.067±0.068，P>0.05)。结论 瓣膜性心房颤动患者心房组织存在明显的心房纤维化，与Ⅰ型胶原基因转录水平上调密切相关。

风湿性心脏瓣膜病；心房颤动；心房纤维化；心房重塑；胶原蛋白

风湿性心脏瓣膜病是我国心房颤动(atrial fibrillation, AF)最常见的病因。研究表明，风湿性心脏瓣膜病患者AF的发生和维持与心房重塑有关。心房重塑分为电重塑和结构重塑，然而其在风湿性心脏瓣膜病患者发生AF时的作用与地位并不相同。普遍认为心脏结构重塑发生在电重塑之前，并且一直持续于电重塑发生过程中，持续性AF患者经复律后，短期内心房电重塑完全消失，而结构重塑却持续存在[1]。心房结构重塑包括：心房腔扩大、心房肌间质改变、心房肌细胞超微结构改变等3个方面[2-3]。本研究选取因风湿性心脏瓣膜病住院进行心脏瓣膜置换手术的患者84例，其中AF患者39例，窦性心律(sinus rhythm, SR)者45例，探讨风湿性心脏瓣膜病AF患者的心房结构特点。

1 材料与方法

1.1 研究对象的选择

选取西安交通大学第一附属医院、西京医院、陕西省人民医院心脏外科2012年5月28日至2012年8月13日因风湿性心脏瓣膜病住院，并进行心脏瓣膜置换手术的患者84例，其中AF患者39例、SR患者45例。入选标准：风湿性心脏瓣膜病且行心脏瓣膜置换术伴或不伴AF者。排除标准：年龄超过65岁、冠状动脉粥样硬化性心脏病、肝肾功能衰竭、糖尿病、甲状腺功能亢进症、高血压病、心肌病、慢性肺原性心脏病、自身免疫病、心力衰竭超过纽约心功能3级、射血分数(EF)值小于40%、风湿热急性活动期、慢性炎症、伴有明显的急性感染者、肿瘤及5个药物半衰期内服用了血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素II受体阻滞剂和醛固酮受体拮抗类药物。本研究通过伦理委员会认可，所有入选病例均签署知情同意书。

1.2 临床资料及血液标本收集、处理、保存

收集整理患者的临床基本资料，包括年龄、性别、血压、现病史、既往史、生化检查、心电图及心脏彩超等。入选患者均于晨起空腹采集肘静脉血5 mL，于4 ℃冰箱静置3 h，离心机分离血清( 室温，1 000 r/min，20 min)，转入-80 ℃低温冰箱保存。

1.3 心房组织标本的获取和HE染色及Masson染色

所有患者于心脏外科手术中建立体外循环，在心脏停跳前获取右心房组织(0.3～0.5 cm3)，除去血液和脂肪组织后每块心房组织切成2块：一块放入EP管用于胶原含量测定及mRNA分离；另一块经40 g/L多聚甲醛溶液固定，用于制作石蜡包埋切片及染色。

1.4 实时荧光定量PCR测定心房组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达

分别提取AF组和SR组患者心房组织的总RNA，经过逆转录成cDNA，进而行实时荧光定量PCR，得到Ⅰ、Ⅲ型胶原的mRNA相对表达量。从Genbank查获目的基因Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的mRNA序列，用Priemer5.0软件设计上下游引物，并应用BLAST引擎对设计的每条引物进行特异性分析，确保每条引物与基因库已知的人类其他基因无同源性。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其目标引物序列如下：Ⅰ型胶原上游引物5′-GCGACAGAGGC ATAAAGGGT-3′，下游引物5′-CCAGGGAGACCGTTGAGTC-3′；Ⅲ型胶原上游引物5′-GAGCTTCCCAGAACATCA-3′，下游引物5′-ATTCCCCAGTGTGTTTCG-3′；内参GAPDH上游引物5′-CCTCCTGCACCACCAACT-3′，下游引物5′-CTTCTGGGTGGCAGTGATG-3′。实时荧光定量PCR程序：94 ℃ 3 min 40循环，94 ℃ 10 s、57.5 ℃ 10 s和71 ℃ 30 s。实验重复3次。反应结束，读取各反应孔的Ct值(Cycle threshold，每个反应体系荧光信号达到阈值时经历的循环数)及溶解、扩增曲线，并进行数据分析，比较其相对表达量2-△△Ct值。

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 SR组与AF组间基本临床资料的比较

将入选患者的SR组和AF组患者的基本资料特征结果分析(表1)表明，两组患者在性别构成比、年龄、血压、血常规、生化指标等差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

表1 两组间临床基本资料比较

项目SR组(n=45)AF组(n=39)t/χ2值P值性别(男/女)19/2624/15 3.0830.086年龄(岁)48.10±10.9051.10±9.00-1.4050.164收缩压(mmHg)115.80±14.30112.40±10.401.2420.218舒张压(mmHg)70.50±11.5071.70±7.40-0.5670.572白细胞(×109/L) 6.00±1.91 6.29±1.55-0.7630.448红细胞(×1012/L) 4.44±0.51 4.55±0.67-0.8110.420血红蛋白(g/L)135.30±16.80137.10±16.60-0.4820.631血小板(×109/L)186.90±54.40187.59±44.701.4210.072血肌酐(μmol/L)91.58±12.4392.47±12.46-0.2250.823尿素氮(mmol/L) 5.80±1.67 6.40±1.86-1.6960.543

2.2 SR组与AF组间心脏超声检查相关参数变化的比较

两组患者的升主动脉内径、肺动脉内径、EF差异无统计学意义(P>0.05)；但AF组左、右心房直径明显大于SR组，组间比较差异有统计学意义(P<0.05，表2)。

表2 两组间心脏超声检查相关参数的比较

项目SR组(n=45)AF组(n=39)t值P值升主动脉内径(mm)32.77±5.8032.75±5.901.5750.085肺动脉内径(mm)25.12±3.3426.42±4.30-1.4710.146射血分数(%)54.47±5.9053.10±5.901.0410.301右心房直径(mm)24.32±4.2626.88±4.811.7210.038左心房直径(mm)49.55±17.1758.03±13.93-2.4200.018

2.3 HE染色与Masson染色观察SR组与AF组间心房组织纤维化程度

HE染色结果显示，SR组患者心房组织可见红色心肌细胞排列整齐、有序；AF组患者心房组织可见心房肌细胞肥大，肌纤维增粗、排列疏松紊乱、大小不一，细胞核大小不一，部分区域肌纤维完全溶解，核异质性明显，心肌间质可见明显纤维组织增生(图1)。

图1 SR组(A)与AF组(B)心房组织HE染色

Fig.1 HE staining of the atrial tissues in SR (A) and AF (B) groups

(×400)

Masson染色结果显示SR组心房组织中可见少量胶原纤维；AF组的心房组织中蓝色胶原纤维组织显著增生，心内膜下、间质中胶原沉积表达量显著增多，在心内膜下、间质中呈条索状穿梭于棕红色心肌细胞之间或迂曲包绕心肌细胞，心肌肌束被大量条索状胶原纤维所分隔(图2)。此外，心房组织Masson染色结果经图像分析的半定量结果亦显示：CVF在AF组显著高于SR组(45.37±2.33vs. 12.90±1.02)，组间比较差异有统计学意义(P=0.002)。

图2 SR组(A)与AF组(B)心房组织Masson染色

Fig.2 Masson staining of the atrial tissues in SR (A) and AF (B) groups(×400)

2.4 SR组与AF组心房组织Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达

实时荧光定量PCR测定结果显示，AF组患者心房组织标本中Ⅰ型胶原的mRNA相对表达(2-△△Ct值，2.042±0.177)明显高于SR组(0.988±0.099)，组间比较差异有统计学意义(P=0.001)；AF组心房组织标本中Ⅲ型胶原mRNA相对表达(2-△△Ct值，1.228±0.151)较SR组增高(1.067±0.068)，但组间比较差异无统计学意义(P=0.341，图3)。

图3 SR组与AF组心房组织Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达的比较

Fig.3 Comparison of expressions of type Ⅰ and Ⅲ collagen mRNA in atrial tissues between SR and AF groups

3 讨 论

众多研究结果表明心房腔的直径与AF的发生有关，左心房直径小于44 mm时，AF的发生率为3%左右；当其直径大于50 mm时，AF发生率上升高达54%[1,4]。同时还有研究表明心房腔直径扩大是AF发生与维持的独立危险因素，左心房的直径每增加5 mm，AF的发生风险增加1.4倍[5-6]。本研究提示：风湿性心脏瓣膜病AF组左、右心房直径均明显大于SR组，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)，这与相关报道一致。这种心房腔直径的扩大可能是瓣膜病变导致的血流动力学异常及心房肌细胞结构改变导致的心房收缩功能障碍共同作用的结果。

目前认为，AF时心房结构重塑最突出的特点是心房纤维化，同时也可能是AF发生和维持的结构基础。心房纤维化指异常胶原纤维沉积于正常心房肌细胞间质中，即胶原纤维含量在正常心房肌细胞间质中含量比例增高[7]。在正常心房组织中，纤维组织在肌间质含量中占2%～4%，临床心房纤维化的定义为胶原纤维组织含量超过心房组织的10%。相关研究显示：与窦性心律者相比，继发于二尖瓣疾病的心房纤颤患者心房中均存在大量的胶原纤维沉积[7-8]。本研究以风湿性心脏瓣膜病伴有AF的患者为研究对象，研究结果显示：AF患者心肌间质纤维组织明显增生，且胶原纤维在房颤患者的心肌组织中沉积亦明显增加。此外半定量分析结果显示：房颤患者的心肌组织中CVF明显高于SR组。形态学及半定量检测胶原结果均提示：心房纤维化在AF患者的心房组织中较SR组明显加重，提示心房纤维化可能与风湿性心脏瓣膜病患者AF的发生与维持密切相关，与相关报道一致[9-10]。

近期研究发现AF患者心房纤维化可能与Ⅰ型胶原基因表达上调有关，而与Ⅲ型胶原关系不明显[11-12]。与窦性心律患者相比，AF患者右心耳组织中Ⅰ型胶原含量增加了48%[13]。本实验用实时荧光定量PCR方法检测Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA，结果显示，与SR组比较，AF患者心房组织中Ⅰ型胶原mRNA表达显著增加。Ⅲ型胶原的mRNA表达在AF组表达较窦性心律虽有增高趋势，但差异无统计学意义，此研究结果与相关研究报道基本一致[14-15]。这些提示这种Ⅰ/Ⅲ型胶原沉积比率失调增加了心房传导的异质性，可能是AF发生和维持的病理基础。但在风湿性心脏瓣膜病AF患者心房组织中Ⅰ型胶原的mRNA表达上调的具体机制值得进一步研究。

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(编辑 国 荣)

Features of atrial structure in patients with valvular atrial fibrillation: a multicenter study

PAN Jun-qiang1, ZHANG Dian-xin2, SHOU Xi-ling1, ZHOU Xin3, SUN Chao-feng3

(1. Department of Cardiology, Shaanxi Provincial People’s Hospital, Xi’an 710068;2. Department of Cardiovascular Diseases, Xijing Hospital of Fourth Military Medical University, Xi’an 710032; 3. Department of Cardiovascular Diseases,the First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, China)

Objective To study the features of atrial structure in patients with valvular atrial fibrillation at the human histological level. Methods For this study, we enrolled 84 patients with rheumatic heart disease who were going to receive cardiac surgery at the First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xijing Hospital, and Shaanxi Provincial People’s Hospital. The patients were divided into the atrial fibrillation group (AF,n=39) and the sinus rhythm group (SR,n=45). Clinical data including baseline demographics, routine laboratory test results and echocardiographics were available for all patients before the surgery. The right atrial tissue (0.3-0.5 mm3) was dissected during the surgery. Right atrial fibrosis was observed by HE staining and Masson staining. mRNAs of type Ⅰ, Ⅲ collagen in atrial tissue were determined by real-time quantitative PCR. Results The two groups did not differ significantly in sex ratio, age, blood pressure, blood biochemical indicators or other aspects of medical history between (P>0.05). However, left and right atrium diameters were significantly larger in the AF group than in the SR group (P<0.05). HE and Masson staining results suggested that atrial tissue fibrosis was obvious, and collagen volume fraction was significantly higher in the AF group than in the SR group (45.37±2.33vs. 12.90±1.02,P<0.05). Expression of type I collagen mRNA was significantly higher in the AF group than in the SR group (2.042±0.177vs. 0.988±0.099,P<0.05); expression of type Ⅲ collagen mRNA was higher in the AF group than in the SR group, but without significant difference (1.228±0.151vs. 1.067±0.068,P>0.05). Conclusion There is significant atrial fibrosis in patients with valvular atrial fibrillation; which is closely related to up-regulated expression of type I collagen gene.

rheumatic heart valvular disease; atrial fibrillation; atrial fibrosis; atrial remodeling; collagen protein

2015-03-13

2015-07-14

国家自然科学基金资助项目(No.81270236) Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.81270236)

孙超峰. E-mail: pjq1980214@163.com

R541.7

A

10.7652/jdyxb201601014

优先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20151208.1656.006.html(2015-12-08)