α-硫辛酸对小鼠卵巢颗粒细胞氧化应激损伤和凋亡的影响

马会明，张永芳，王蒙蒙，李 昕，王永峰，田洪成，裴秀英，王燕蓉

(宁夏医科大学/生育力保持教育部重点实验室/宁夏回族自治区生殖与遗传重点实验室/宁夏医科大学总医院生殖医学中心/人体解剖与组织胚胎学系，宁夏银川 750004)



α-硫辛酸对小鼠卵巢颗粒细胞氧化应激损伤和凋亡的影响

马会明，张永芳，王蒙蒙，李 昕，王永峰，田洪成，裴秀英，王燕蓉

(宁夏医科大学/生育力保持教育部重点实验室/宁夏回族自治区生殖与遗传重点实验室/宁夏医科大学总医院生殖医学中心/人体解剖与组织胚胎学系，宁夏银川 750004)

目的 探讨α-硫辛酸对小鼠颗粒细胞培养过程中抗氧化水平和抗凋亡水平的影响。方法 收集经PMSG处理的小鼠卵巢颗粒细胞，经原代培养24 h后，添加终浓度为100 μmol/L的α-硫辛酸继续培养24 h，测定氧化水平SOD、MDA和GSH-Px参数，评价抗氧化能力，采用Trizol法提取各组细胞的RNA，进行RT-PCR法检测α-硫辛酸对caspase-3和caspase-9基因的表达情况的影响，同时利用细胞免疫荧光和ELISA法检测caspase-3和caspase-9蛋白表达，并分析α-硫辛酸降低细胞凋亡的作用。结果 分离培养的小鼠卵巢颗粒细胞α-硫辛酸添加后，SOD和GSH-Px活性升高，MDA含量降低(P<0.05)；经过RT-PCR扩增技术获得长度为180 bp的特异性caspase-3产物，获得长度为152 bp的特异性caspase-9产物，α-硫辛酸添加可显著性降低caspase-3和caspase-9 mRNA的表达(P<0.05)；免疫荧光细胞化学染色显示颗粒细胞caspase-3和caspase-9蛋白阳性染色定位于细胞胞质，分别呈现绿色荧光和红色荧光，细胞核呈蓝色荧光；ELISA结果显示α-硫辛酸添加后caspase-3和caspase-9酶活性显著下调(P<0.05)。结论 小鼠颗粒细胞培养过程中添加α-硫辛酸可明显改变细胞抗氧化能力，对卵巢颗粒细胞培养过程中的氧化应激诱导的细胞凋亡起到一定的保护作用。

α-硫辛酸；氧化应激；细胞凋亡；卵巢颗粒细胞；小鼠

α-硫辛酸(α-lipoic acid, α-LA)是一种类似维他命的水溶性和脂溶性代谢天然的抗氧化物质。它具有独特双硫键的抗氧化分子结构，是强效的抗氧化剂，能保存和再生其他抗氧化剂[1]，α-LA与其还原产物二氢硫辛酸协同抑制自由基的损伤，降低氧化应激，减少脂质过氧化[2]，维持机体正常的抗氧化水平。有证据证明[3]，α-LA通过减少施旺细胞8-羟化脱氧鸟苷(8-hydroxy-2’-deoxyguanosine, 8-OHdG)的形成和线粒体去极化，降低细胞的凋亡。有文献报道[4]，α-LA可以抑制凋亡分子途径的激活，有效地调节氧化应激所致凋亡事件的影响，从而停止活性氧(reactive oxygen species, ROS)自由基的活性，减少线粒体膜电位的损失，降低氧化应激的发生，降低caspase-3和caspase-9的活性。张毅等[5]应用不同浓度硫辛酸显著降低神经细胞内脂质过氧化反应，提高细胞抗氧化能力，提高细胞的生存率，延缓老化的进程。鉴于目前文献有关α-LA对卵巢颗粒细胞抗氧化和抗凋亡的的保护作用机制的报道不多。本研究利用α-硫辛酸的强氧化剂的特性，通过抗氧化水平和细胞凋亡表达的检测来研究α-硫辛酸对氧化应激诱导的小鼠卵巢颗粒细胞凋亡起保护作用的相关机制，探讨α-硫辛酸对颗粒细胞的氧化应激水平和凋亡程度的抑制作用，为α-硫辛酸在细胞培养过程中降低氧化应激、减少凋亡的发生提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 药品及试剂

兔抗人caspase-3和caspase-9多克隆抗体购自碧云天生物；β-actin兔单克隆抗体、羊抗兔二抗及ECL化学发光试剂盒购自博士德生物；蛋白提取试剂盒购自南京凯基生物公司。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)试剂盒(批号：20100119)，丙二醛(malonaldehyde, MDA)试剂盒(批号：20100119)，谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)试剂盒(批号：20100119)，均由南京建成生物工程研究所提供。Caspase-9活性检测试剂盒(20T)(批号：C1157)，caspase-3活性检测试剂盒(20T)(批号：C1115)，均由碧云天生物提供。

1.2 颗粒细胞的采集和体外培养

取18～22 g未成熟的雌性ICR小鼠(购自宁夏医科大学实验动物中心)，每只腹部皮下注射PMSG 10 IU，36～48 h后颈椎脱臼法处死。在无菌条件下迅速剖取卵巢放入无菌的PBS中清洗，再置于含100 IU/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的TCM199-Hepes培养基中刺破卵巢使颗粒细胞释放于培养基中，再离心、1 mg/mL透明质酸酶消化，收集颗粒细胞单细胞并调整细胞密度为5×105cells/mL。将细胞悬液分装在6孔培养板中在50 mL/L(体积分数)的CO2，37.5 ℃条件下于M199完全培养液(M199∶FBS=9∶1)中孵育24 h。贴壁后更换新鲜培养基，并加入终浓度为100 μmol/L的α-硫辛酸(不加α-硫辛酸处理的细胞为对照组)处理细胞24 h，然后开始进行后续试验。所有动物实验均遵循实验动物的伦理要求和实验动物管理条例。

1.3 颗粒细胞SOD、MDA和GSH-Px测定

α-硫辛酸处理细胞24 h后，按组别收取6孔板中的处理组细胞和正常对照组细胞培养上清液，离心2 500 r/min 5 min后分离上清，按SOD、MDA和GSH-Px试剂盒说明书操作，分别测定细胞培养液上清中的SOD、MDA和GSH-Px含量。

1.4 颗粒细胞RNA提取及caspase-3和caspase-9 mRNA分析

采用Trizol一步抽提的常规方法提取RNA，浓度测定后进行cDNA第一链的逆转录合成，琼脂糖凝胶电泳检测RNA和cDNA，再根据caspase-3引物序列(180 bp)：上游：5′-ATGGCTTGCCAGAAGATACC-3′；下游：5′-CCTGTTAACG-CGAGTGAGAA-3′；caspase-9引物序列(152 bp)：上游：5′-CAACTTGGACCGTGACAAAC-3′；下游：5′-ATGACCACCACAAAGCAGTC-3′；β-actin引物序列(133 bp)上游：5′-GGTCATCACTATTGGCAACG-3′；下游：5′-ACGGATGTCAACGTCACACT-3′进行RT-PCR法caspase-3和caspase-9基因扩增，PCR反应条件如下：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s；56 ℃ 45 s；72 ℃ 45 s；72 ℃ 10 min；进行30个循环；PCR产物琼脂糖凝胶电泳条带进行扫描拍照分析。Real-time PCR检测在ABI 7500 fast荧光定量PCR仪中进行，caspase-3和caspase-9基因相对表达量用2-ΔΔCt法计算，β-actin为内参基因。

1.5 细胞免疫荧光化学检测caspase-3和caspase-9的表达

α-硫辛酸处理细胞24 h后，按照实验室常规方法固定、漂洗、TritonX-100通透、封闭，按1∶300稀释兔抗人caspase-3和caspase-9多克隆抗体，湿盒4 ℃孵育过夜，阴性对照用PBS代替一抗；PBS洗3次，每次5 min；取出培养板，加CY3和FITC标记的羊抗兔IgG(1∶200)荧光二抗室温避光孵育1 h；PBS洗5次，每次5 min，再加入300～400 μL DAPI染核并抗荧光淬灭剂封固，荧光显微镜下观察并避光拍照。

1.6 颗粒细胞caspase-3和caspase-9活性的检测

α-硫辛酸处理细胞24 h后，去除试验组和空白对照组培养液， 用胰酶消化细胞，1 000 r/min 4 ℃离心5 min收集细胞，小心吸除上清，PBS洗涤一次。同前吸尽上清后，按照每200万细胞加入100 μL裂解液的比例加入裂解液，重悬沉淀，冰浴裂解15 min。4 ℃ 14 000 r/min离心10～15 min。把上清转移到冰浴预冷的离心管中。取少量样品用Bradford法测定蛋白浓度，尽量使蛋白浓度达到3 mg/mL，相当于每10 μL待测样品中含有10～30 μg蛋白，以10 μL 2 mmol/L的Ac-DEVD-pNA和Ac-LEHD-CHO分别被用作caspase-3和caspase-9的显色底物，释放的pNA和CHO立即用405 nm测定吸光度值确定caspase-3和caspase-9的酶活性。

1.7 统计学处理

2 结 果

2.1 α-硫辛酸对SOD、MDA和GSH-Px的影响

与对照组培养细胞上清液比较，采用黄嘌呤氧化酶法于550 nm处对SOD活力的测定结果显示，100 μmol/L的α-硫辛酸处理颗粒细胞SOD酶活性升高(P<0.05)；采用TBA法于532 nm处测定MDA含量的结果显示，α-硫辛酸处理后细胞上清液中MDA含量降低(P<0.05)；根据酶促反应中GSH的消耗速度来反映GSH-Px的活力的原理，实验结果显示，α-硫辛酸处理后细胞上清液中GSH-Px活性升高(P<0.05，表1)。

表1 α-硫辛酸对卵巢颗粒细胞SOD，MDA和GSH-Px活性的影响

组别SOD(U/mL)MDA(μmol/L)GSH-Px(μmol/L)对照组15.69±1.083.82±0.2260.31±10.29α-硫辛酸组20.55±0.96*2.63±0.29*102.47±21.43*

与对照组比较，*P<0.05。

2.2 α-硫辛酸对caspase-3和caspase-9 mRNA表达的影响

提取颗粒细胞总RNA，浓度测定时OD260/OD280比值为1.8～2.0，均符合RNA质量要求。RT-PCR检测结果如图1A和B显示，caspase-3和caspase-9 mRNA分别在180 bp、152 bp处可观察到特异性条带，内参β-actin条带亮度相近；Real-time PCR检测结果显示，与对照组相比，添加α-硫辛酸处理后caspase-3和caspase-9 mRNA表达显著性降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 卵巢颗粒细胞caspase-3和caspase-9基因表达 RT-PCR和Real-time PCR检测结果

Fig.1 Expressions of caspase-3 and caspase-9 mRNA in the ovary granulose cells detected by RT-PCR and Real-time PCR
A：caspase-9 mRNA表达(1：α-硫辛酸组；2：对照组)；B：caspase-3 mRNA表达(3：对照组；4：α-硫辛酸组)。

2.3 α-硫辛酸对caspase-3和caspase-9蛋白表达的影响

细胞免疫化学染色结果如图2显示，添加α-硫辛酸处理后细胞免疫荧光检测显示，caspase-3和caspase-9存在于卵巢颗粒细胞中，caspase-3和caspase-9阳性染色定位于细胞质和细胞膜，呈绿色荧光着染，细胞核呈深蓝色荧光，镜下可见。

图2 卵巢颗粒细胞caspase-3和caspase-9蛋白表达细胞免疫荧光检测

Fig.2 Expression of caspase-3 and caspase-9 protein of the ovary granulose cells detected by immunofluorescence (×200)
A：caspase-3蛋白表达；B：caspase-9蛋白表达。

2.4 α-硫辛酸对凋亡蛋白caspase-3及caspase-9酶活性的影响

酶标仪测定颗粒细胞溶蛋白性裂解产物中caspase-3和caspase-9酶的活性结果显示(如图3所示)，与对照组相比，添加α-硫辛酸处理后可引起颗粒细胞caspase-3和caspase-9酶活性显著性降低(P<0.05)。

3 讨 论

卵巢颗粒细胞是成熟卵泡中最大的细胞群，其包围且营养着卵母细胞，在维持卵母细胞成熟的微环境中起着极为重要的作用。因此，颗粒细胞体外培养是一个较好的评价卵巢功能及卵母细胞质量的系统[6]。大量研究表明，卵巢颗粒细胞的凋亡才是卵泡退化的根本原因。有研究也表明卵泡液中颗粒细胞自身的凋亡导致了卵泡的闭锁，从而减少可发育并排出的卵子数目[7]。有研究发现PCOS患者颗粒细胞的凋亡降低了卵子的质量，颗粒细胞的凋亡导致相应卵子发育质量欠佳， 使其受精、卵裂及后续的胚胎发育过程均受影响[8]。而且分离获得的PCOS患者颗粒细胞培养过程中，颗粒细胞凋亡率高的卵子质量低下。氧化应激时过量的ROS主要损伤细胞大分子，如DNA、蛋白质及膜磷脂，导致DNA突变或裂解，细胞内重要酶的失活及细胞膜脂质过氧化[9]。

图3 α-硫辛酸对颗粒细胞caspase-3和caspase-9酶活性的影响

Fig.3 Effect of α-lipoic acid on caspase-3 and caspase-9 activities in the ovary granulose cells
A：caspase-9酶活性；B：caspase-3酶活性。

α-硫辛酸是一种较强的天然抗氧化剂，可通过清除自由基，恢复氧化还原平衡，降低细胞凋亡的发生。有文献报道[10]，α-LA通过降低神经膜细胞的丙二醛含量及增加超氧化物歧化酶活性，抑制氧化应激，改善高糖导致的神经膜细胞凋亡，从而对改善糖尿病周围神经病变起重要作用。研究显示α-LA能够显著降低大鼠成纤维细胞内MDA含量及ROS水平并提高SOD活力，且能明显降低caspase-3的活性，改善高糖诱导的氧化应激损伤[11]。本实验将α-LA应用于小鼠卵巢颗粒细胞的培养中，结果发现α-LA显著性减少细胞内MDA含量，提高细胞SOD活力，升高细胞内GSH-Px活性(P<0.05)，这与JIA等[12]研究α-LA能够有效保护SD大鼠晶状体上皮细胞免受氧化应激造成的SOD，MDA和GSH-Px酶活性下降的结论一致，也与文献[13]中α-硫辛酸减轻耳蜗损伤中MDA含量的结论一致。也进一步证明抗氧化剂可以降低细胞脂质过氧化反应，减少氧化应激损伤，与以往研究报道结果一致[14]。

细胞经历诱发凋亡因素刺激时，caspase分子以酶原的形式被合成，必须经历自我剪切、激活的复合物形成等过程，这一过程一旦被激活，其中起始的caspase会特异性地剪切激活效应的caspase酶原，在凋亡的内源性通路中起始分子caspase-9被激活，进一步激活哺乳动物凋亡过程中的关键蛋白酶caspase-3等，导致细胞凋亡发生。在正常情况下，caspase-3以无活性的pre-caspase-3形式存在，当细胞发生凋亡时则变为执行功能的、有活性的caspase-3，可使细胞质、细胞核及细胞骨架的重要蛋白质降解失活。研究证明，α-LA刺激心肌细胞，阻断ERS启动的凋亡通路，caspase-12蛋白表达减少，凋亡明显降低[15]。本实验发现α-LA减少氧化应激，抑制卵巢颗粒细胞凋亡，这与caspase-3和caspase-9的表达密切相关，酶活性检测结果显示α-LA处理引起颗粒细胞caspase-3和caspase-9酶活性显著性降低。这一结果也进一步证明了α-LA降低凋亡的作用与caspase-9和caspase-3紧密相关，颗粒细胞线粒体介导的caspase-9和caspase-3途径激活，发生剪切，而诱导细胞凋亡。这一结果与KIM等[16]和KAYA-DAGISTANLI等[17]报道的α-LA降低耳蜗毛细胞株HEI-OC1细胞和SD大鼠肝细胞caspase-3活性的结论一致，这一结果也证明抗氧化剂可以充分降低caspase酶原的活性[18]。

本研究中，颗粒细胞处理过程中caspase-9分子激活，继而使caspase-3分子活化，致使颗粒细胞凋亡，添加α-LA减少了细胞这一凋亡的发生。这一凋亡的信号能否传递到细胞内并募集、激活caspase-2、caspase-8、caspase-10等分子，最终导致细胞的凋亡发生，将作为我们继续研究的方向。

总之，α-硫辛酸降低颗粒细胞培养过程中凋亡蛋白caspase-9和caspase-3分子的表达，对卵巢颗粒细胞的氧化应激诱导的凋亡起到保护作用。

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(编辑 韩维栋)

α-lipoic acid protects mouse ovarian granulosa cells from oxidative stress and apoptosis

MA Hui-ming, ZHANG Yong-fang, WANG Meng-meng, LI Xin, WANG Yong-feng,TIAN Hong-cheng, PEI Xiu-ying, WANG Yan-rong

(Key Laboratory of Fertility Preservation and Maintenance of Ministry of Education;Department of Anotomy and Histology-embryology, Ningxia Medical University;Fertility Center for Reproductive Medicine, Ningxia Medical University,Yinchuan 750004, China)

Objective To study the protective effects of α-lipoic acid on oxidative stress and apoptosis of mouse ovary granulose cells culturedinvitro. Methods Granulosa cells were collected from PMSG-treated mice and cultured in DMEM/F12 medium for 24 h; then the cell medium was supplemented with 100 μmol/L α-lipoic acid for 24 h culture. After α-lipoic acid treatment, SOD, MDA and GSH-Px activities in cell supernatant were measured. Additionally, RT-PCR, immunocytochemistry and Western blot were performed to detect the expressions of caspase-3 and caspase-9. Immunofluorescence and ELISA were used to evaluate the expressions of caspase-3 and caspase-9 at the protein level in whole granulosa cell lysate protein in both groups. Results α-lipoic acid supplementation increased SOD and GSH-Px activities and decreased MDA content notably (P<0.05). PCR products of caspase-3 and caspase-9 in granulosa cells were analyzed using RT-PCR and Real-time PCR. The expected 180 bp product was verified for caspase-3 and 152bp for caspase-9 by electrophoresis and gel imager in α-lipoic acid group and control group. Expressions of caspase-3 and caspase-9 at mRNA level showed a decreased tendency in α-lipoic acid group (P<0.05). For immunofluorescence analysis, caspase-3 and caspase-9 protein of granulosa cells was detected. Cell-specific positive staining was located in the cytoplasm of the granulosa cells which showed green fluorescence for caspase-3 and caspase-9 protein; cell nuclei showed blue fluorescence. In α-lipoic acid group it has a lower bands density values than the control group by Western blot analysis (P<0.05). ELISA assay showed a significant decrease of caspase-3 and caspase-9 activities in α-lipoic acid group (P<0.05). Conclusion α-lipoic acid can significantly change the anti-oxidation ability of mouse ovarian granulosa cells, which suggests that it has protective and antioxidant effects on oxidative stress and apoptosis during the culture of mouse ovarian granulosa cells.

α-lipoic acid; oxidative stress; apoptosis; ovary granulosa cell; mouse

2015-04-22

2015-08-22

宁夏自然科学基金资助项目(No.NZ11128) Supported by the Natural Science Foundation of Ningxia (No.NZ11128)

裴秀英. E-mail: peixiuying@163.com；王燕蓉. E-mail: 4083304@163.com

R711.6

A

10.7652/jdyxb201601010

优先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20151209.1554.006.html(2015-12-09)