不同微藻培养方式产生虾青素及其影响因素的研究现状

郭晓茜,任丹丹,张继红,任先见,汪秋宽

(大连海洋大学食品科学与工程学院,辽宁大连 116023)



不同微藻培养方式产生虾青素及其影响因素的研究现状

郭晓茜,任丹丹*,张继红,任先见,汪秋宽

(大连海洋大学食品科学与工程学院,辽宁大连 116023)

虾青素具有多种重要生理功能,已广泛引起人们的重视,微藻是虾青素的主要来源之一。本文综述了在自养、异养及混养三种培养方式下微藻积累虾青素的研究现状及影响因素,并分析了不同培养方式的的优缺点,以期为虾青素的微藻高效生产提供参考。

微藻,自养,异养,混养,虾青素,影响因素

微藻的培养方式主要分为自养、异养和混养。自养培养为微藻的主要培养方式,是微藻通过光合作用利用光能和CO2进行生长。微藻的异养培养是指在培养基中添加有机碳源和(或)有机氮源而不依赖光照进行增殖的过程。可进行异养培养的微藻具有生长周期短、生长速率高、生物质浓度高(可达到50～100 g/L)等优点[1]。微藻混养培养是在利用光能和CO2的同时,以有机碳(葡萄糖)作为补充碳源和能源的一种培养方法,可以不受光的限制,从理论上讲,能取得较高的产量[2]。异养培养已成为国内外一种快速、大量培养微藻的有效方法和发展方向。由于异养和自养培养条件不同,因而使微藻所含的营养成分发生明显的变化。

虾青素(astaxanthin)是一种重要的类胡萝卜素。它可淬灭单线态氧,清除自由基,阻止脂质过氧化,保护机体免受伤害,预防癌症发生,还能促进人体免疫球蛋白的产生,具有很高的免疫调节活性[3]。虾青素抗氧化能力是β-胡萝卜素的10倍,维生素E的500倍,被誉为“超级维生素E”,在食品及医药方面有着广泛的应用前景。同时它是一种良好的着色剂,在水产养殖等方面具有重要的应用价值[4]。本文对自养、异养和混养三种培养方式下生产虾青素的研究现状进行了综述,以期为微藻高效生产虾青素提供参考。

1　自养培养方式

雨生红球藻是天然虾青素最好的来源之一,目前国内外已采用雨生红球藻Haematococcuspluvialis通过自养来生产虾青素[5]。雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)是一种常见的生存于淡水中的单细胞绿藻。在其生长周期中明显地呈现出两个阶段:在生长条件适宜的情况下该藻以绿色带鞭毛的可游动细胞形态大量繁殖;在生长环境不利的情况下,绿色游动细胞逐渐丧失鞭毛、细胞壁加厚、形成红色包囊,同时细胞质油脂小泡中大量积累虾青素。此藻在不利条件下积累虾青素,并且具有普通微藻所需营养简单的特点,因此被认为是生产虾青素最好的自然资源。雨生红球藻由于培养周期较长,易受其他藻类和原生动物的污染等不利因素的影响,其大规模的培养一直是虾青素生产的壁垒[6]。自养培养是目前生产虾青素的主要培养方式,密闭式光生物反应器光自养培养雨生红球藻在产率上有较大的提高,培养过程易于控制,可有效避免污染,质量和产量也比较稳定。但由于设备成本高、技术不成熟、光照限制等原因,迄今尚未应用于大规模养殖。开放式户外大池光自养培养是目前雨生红球藻大规模商业化生产的主要培养方式,具有设施简易、投资少、成本低等优点,但具有占地面积大、生长条件难以控制、采收成本高、易受其它生物污染、藻粉质量低等缺点,限制了开放池培养的进一步发展[7]。

影响虾青素积累的影响因素有很多,如光照、温度、通气速率、营养盐、pH以及一些化学调节剂等,可通过影响雨生红球藻光合作用效率从而影响微藻的生长。前些年的研究主要是通过改变光照强度、温度、通气速率及pH等方式来诱导虾青素的合成。有文献报道,当将微藻细胞暴露在氮饥饿、高盐度、高温和高光照强度的条件下,就可以促进虾青素的产生[8]。Minxi Wan等通过改变温度对自养雨生红球藻虾青素积累的情况进行了研究,在光照强度为250 μmol photons m-2·s-1,pH为7.5～8,光暗周期为12 h∶12 h,通气速率为0.04 vvm条件下的条件下,保持夜间温度为28 ℃,白天温度从8～33 ℃开始变化,或者白天温度保持28 ℃不变,夜间温度从8～33 ℃开始变化。研究表明当白天培养温度为23～28 ℃,夜间培养温度低于28 ℃时刺激夜间虾青素积累,虾青素最高含量达2.3 mg/L/d,使虾青素含量最高达对照组的2.9倍[9]。低温会抑制微藻的生长繁殖,但有利于类胡萝卜素的积累,因此当白天温度高于28 ℃,有利于微藻的生长繁殖,而降低夜间培养温度有利于虾青素的积累。据已知报道自养微藻通过向培养基中添加氮、磷、硫、铁等物质,可以大量积累微藻中的虾青素,且营养物的种类与虾青素积累的速率有关。而光照强度和光质也对虾青素合成产生影响,Del Campo等人报道了当连续增加光照强度时可成倍增加虾青素的含量[10]。

近5年来,人们对微藻自养积累虾青素的调节机制已有了较充分的研究和认识,因此通过添加化学调节剂诱导与虾青素素有关的基因表达来增加藻体虾青素含量的研究越来越多,也是优化自养产生高含量虾青素的有效途径。Boussiba研究发现抑制细胞分裂可诱导虾青素的积累,这意味着只要有能抑制细胞分裂的任何因素,就可以诱导虾青素的积累[8]。Yongteng Zhao等通过添加黄腐酸来增加新型雨生红球藻LUGU中虾青素含量,当温度在25 ℃,照明强度在30 μmol photons m-2·s-1,通气速率为0.01 vvm条件下,研究表明相比于对照组,在添加5 mg/L FA和10 mg/L FA时,使虾青素含量增加了86.89%和9.87%,最大虾青素产量为20.82 mg/L[11]。这是由于在培养基中添加FA诱导PDS(八氢番茄红素脱饱和酶),LCY和CHY(β-胡萝卜素羟化酶)基因上调,导致虾青素含量升高。Zewen Wen等研究了通过添加乙醇诱导雨生红球藻中虾青素积累和类胡萝卜素生物合成基因的表达,当光照强度为25 μmol photons m-2·s-1或150 μmol photons m-2·s-1,温度维持在25 ℃,pH为7的条件下,研究表明在低光照条件下添加3%的乙醇可使微藻中虾青素生产率达11.26 mg/L/d,是对照组的2.03倍,说明乙醇能有效地诱导虾青素合成[12]。Zhengquan Gao等研究了通过添加水杨酸诱导雨生红球藻中虾青素积累和八种类胡萝卜素基因的转录表达。当光照强度为25 μmol photons m-2·s-1,温度维持在20 ℃,光暗周期为12 h∶12 h的条件下,研究表明50 mg/L的水杨酸为积累虾青素的最适浓度,水杨酸能诱导虾青素积累可能的原因是上调与虾青素积累有关的8种类胡萝卜素基因[13]。Yandu Lu等研究了茉莉酮酸甲酯和赤霉素A3通过上调β-胡萝卜素酮醇酶基因的转录诱导雨生红球藻中虾青素积累,当光暗周期为12 h∶12 h,温度维持在25 ℃条件下,高浓度的茉莉酮酸甲酯和赤霉素A3可诱导上调三种不同的bkts基因,致使虾青素大量积累[14]。S. Kathiresan研究了通过生物合成关键酶β-胡萝卜素酮醇酶(β-carotene ketolase,BKT)来增加雨生红球藻中虾青素的含量。结果发现在雨生红球藻中总类胡萝卜素和虾青素的含量相比于对照组高2～3倍[15]。Xinheng Yu等研究了8组23种(抗氧化剂、氧化剂、信号转导物、金属离子、植物激素、赤霉素、细胞分裂素和胺类)化学调节剂对雨生红球藻虾青素产量的影响。当培养温度为20 ℃,持续光照强度为20 μmol photons m-2·s-1的条件下,氧化剂和信号转导物显著增加雨生红球藻中虾青素含量,这说明化学分子可以通过调节细胞内代谢机制来增加虾青素含量[16]。

利用雨生红球藻生产虾青素的关键在于:既能提高藻的生物量,又能促进虾青素的快速合成。之后利用高光照、营养盐饥饿、细胞分裂抑制物的产生等诱导条件,都可使细胞分裂速度下降,从而导致个体细胞内虾青素的快速积累。虾青素的积累和藻细胞的生长往往呈相反趋势:即当条件适宜藻细胞生长时,虾青素的合成速率通常较低,虾青素的快速积累发生在不利于藻细胞生长的环境条件下。

2　混养培养方式

混养培养微藻可作为增加光诱导色素产量的一种有效途径。混养是吸收CO2和有机碳,同时进行光合作用和呼吸作用,因此在光限制条件下,大多数微藻的混养比生长速率约等于自养和异养比生长速率之和[17]。采用混养培养方式可快速大量的积累虾青素,但在培养过程中容易滋生大量杂菌,难以实现微藻的高密度培养。目前主要用小球藻Chlorellazofingiensis来混养生产虾青素。C.zofingiensis是一种单细胞绿藻,属于绿藻门,绿藻纲,绿球藻目,卵囊藻科,小球藻属[18]。生长速度快,易培养,抗污染能力强,环境适应能力强,细胞浓度较大,已成为生产虾青素另一重要的微藻资源。C.zofingiensis的培养方式主要有混合营养培养与异养培养[19]。

Po-Fung Ip等研究了通过混养Chlorellazofingiensis增加虾青素产量,比较了不同葡萄糖和硝酸盐浓度对绿藻色素形成的影响,当培养温度为30 ℃,持续光照强度为130 μmol photons m-2·s-1,pH为6.5的条件下,结果表明在混养培养Chlorellazofingiensis通过添加高浓度葡萄糖和低浓度硝酸盐易于积累虾青素,其最高虾青素产量为12.5 mg/L[20]。有关于对研究Chlorellazofingiensis发现,当光照强度为350 μmol photons m-2·s-1,并且利用氮饥饿的方法积累虾青素其最高产量为7.49 mg/L[21]。经过比较发现同一藻种,采用相似的培养条件,其积累虾青素产量的差异是巨大的。采用混养的方式可以大量积累所选藻种的生物量,但是过高的生物量不利于虾青素的积累。目前有关混养微藻积累虾青素的文献比较少,因为采用混养方式积累虾青素的影响因素很多,其中自养、异养的影响因素均会对自养产生影响,条件难以精确控制。其最大的问题是大规模培养过程中容易滋生大量杂菌,难以实现微藻的高密度培养。

3　异养培养方式

同混养一样,目前主要用小球藻Chlorellazofingiensis来异养生产虾青素。异养培养方式具有不受环境和气候等条件的限制、能够实现较高的细胞浓度和生产效率,从而降低生产成本、可借鉴和利用较成熟的工业发酵设备和技术等优点[7]。

在异养微藻条件下,细胞内积累虾青素的主要影响因素为培养基中有机物的浓度和C/N比等。对异养微藻来说,最主要的影响因素是有机物浓度,由于异养微藻具有可吸收有机碳源来满足自身生长繁殖需要的能力,在提供有机碳源的培养条件下配合胁迫处理方法可以在较短的时间内积累大量的虾青素[22]。Po-Fung Ip等研究发现当温度为30 ℃,pH为6.5的条件下,设置三个葡萄糖初始浓度为10、30、50 g/L,初始C/N比为18、55、90、180。在异养培养基中添加葡萄糖浓度为50 g/L时,得到最大虾青素产量为10.3 mg/L。在无光照条件下,虾青素的形成取决于培养基中初始C/N比,较高的C/N比有利于虾青素的形成,最高可达1.2 mg/g[23]。Po-Fung Ip等还通过添加活性氮过氧亚硝酸盐(RNS)和活性氮中间体硝酰氯(RNI)诱导小球藻提高虾青素含量。当温度为30 ℃,pH为6.5的条件下,添加1 mmol/L RNS进行异养培养使虾青素含量从9.9 mg/L增至11.78 mg/L。用0.1 mmol/L亚硝酸钠和0.5 mmol/L次氯酸钠反应生成硝酰氯也增加了虾青素的含量至10.99 mg/L,这说明合适的RNS/RNI比在无光条件下易于诱导虾青素的形成[24]。陈涛等研究了葡萄糖、蔗糖和果糖对小球藻异养生长及虾青素含量的影响,结果表明当糖浓度在20～50 g/L范围内,随着糖浓度的升高,细胞内虾青素含量也升高。在糖浓度为20 g/L时,细胞生长较快但干重较小,虾青素含量较低,在糖浓度为50 g/L时,细胞生长较慢,但干重较大,虾青素含量较高。三种碳源中蔗糖和葡萄糖效果较好,在蔗糖浓度为50 g/L时,虾青素含量和产量分别达到0.94 mg/g和9.61 mg/L,由此说明不同碳源对细胞生长和合成虾青素有显著影响[3]。Ni Sun等研究通过用葡萄糖、甘露糖、果糖、蔗糖、半乳糖和乳糖研究在异养小球藻中对虾青素积累的影响。研究发现葡萄糖和甘露糖作为异养小球藻的最佳碳源能获得较高的生长速率(0.03 h-1)和细胞干密度(10 g/L),进而积累较高的虾青素浓度为1 mg/g[25]。

通过研究发现在培养基中添加有机碳源、氮源可增加微藻的生物量,但是过高的起始浓度会抑制微藻的生长,进而减少虾青素的合成。因此利用Chlorellazofingiensis生产虾青素的关键在于:既能提高藻的生物量,又能促进虾青素的快速合成。首先利用Chlorellazofingiensis最优生长条件促使藻细胞生物量增加,通常利用有机碳(如葡萄糖和醋酸盐等)进行异养培养来提高藻细胞生物量。然后诱导虾青素的快速合成,虾青素积累的诱导条件包括高温、营养盐(氮、磷)饥饿、盐胁迫、细胞分裂抑制剂、氧化压力(活性氧、自由基和溶解氧等)以及两种或两种以上诱导条件的联合作用,如高温和盐胁迫、高光照和氮饥饿等。通常,氮源限制和高光照是生产虾青素的有效方法[26]。

4　展望

微藻作为类胡萝卜素来源具有广阔的应用前景。自养培养微藻具有易于培养、光合利用效率高、生物周期短等优点。目前主要是利用光生物反应器自养培养微藻,其存在一些限制因素,如占地面积大;细胞密度较高时,由于藻细胞之间互相遮蔽,使内部的细胞难以得到充分的光照,严重影响生物量;温度和光照控制比较困难;运行成本太高等[17]。与自养培养方式相比,采用微藻异养培养方式进行虾青素方面的研究,具有很多优势,例如无需光照、生长周期短、生长速率高、生物质浓度高等优点。异养培养可以利用传统发酵设备生产高价值产品,因而具有更强的市场竞争力[27]。微藻异养培养使整个操作流程具有较高的可控性,不依赖于外界环境。但是,并不是所有的微藻都能进行异养生长且异养培养微藻是必须严格控制在无菌条件下,微藻培养的无菌化是进行异养培养的前提和关键。因为在异养培养基中生长迅速的细菌会很快污染整个培养基,并大大限制微藻的生长。混养培养是自养和异养培养方式的结合,这种培养方式可以较好地发挥自养和异养两种培养方式的长处,但此种方式目前尚难以用于规模化生产,一个重要原因是在细胞密度较高时难以提供有效的光照[28]。

本文主要对影响微藻自养、异养及混养的影响因素进行了归纳总结,这为下一步微藻精确培养提供了参考依据。通过自养、混养及异养培养方式对微藻中虾青素积累情况比较发现,在自养条件下,光照强度是最主要的影响因素之一。适当的光照强度会增加藻体的生长速率,有利于大量积累微藻生物量,但是过高的藻体密度会导致部分微藻未受到光照不利于虾青素等高附加值产物的合成。同样条件下采用异养培养方式培养微藻可避免由于光照带来的影响,但是并不是所有的微藻都可以进行异养生长,因此对于可进行异养生长的藻种的筛选是至关重要的。

目前,微藻主要应用于饵料及饲料方面。微藻特有的色素如虾青素等对水产养殖的虾和鱼具有很好的着色作用。微藻作为海洋药物的重要来源,所含有的生物活性物质如抗生素、色素、多糖、DHA和EPA等具有抗肿瘤、抗病毒、抗真菌、防治心血管疾病、防治老年人痴呆症等多种功能。其次微藻可用作生物柴油,具有环保、安全、燃烧充分、可再生性等特性,大力发展生物柴油对经济社会可持续发展,能源循环利用,节能减排等具有重要意义[18]。

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Research advances on astaxanthin produced under different microalgae cultured methods and their influential factors

GUO Xiao-xi,REN Dan-dan*,ZHANG Ji-hong,REN Xian-jian,WANG Qiu-kuan

(College of Food Science and Engineering,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China)

Nowadays much attention has been paid to bioactivities of astaxanthin,especially those from natural resources of microalgae. The research advances on production of astaxanthin by microalgae under different conditions including autotrophic,heterotrophic and mixotrophic method were reviewed in this paper. Advantages and disadvantages of each cultured method and their influential factors were also compared. It provided the basis for the efficient production of astaxanthin.

microalgae;autotrophic;heterotrophic;mixotrophic;astaxanthin;influential factors

2016-02-26

郭晓茜(1991-)，女，硕士研究生，研究方向：食品营养与安全，E-mail：Gracy0909@163.com。

任丹丹(1980-)，女，博士，副教授，研究方向：海洋生物资源利用， E-mail：rdd80@163.com。

国家自然科学基金(31301449)；辽宁省高校优秀人才项目(LJQ2014077)； 辽宁省农业领域青年科技创新人才项目(2015005)。

TS254.2

A

1002-0306(2016)17-0381-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.17.067