慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者乙型肝炎病毒前C/CP区变异研究进展*

黄鹏宇综述，徐东平审校

慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者乙型肝炎病毒前C/CP区变异研究进展*

黄鹏宇综述，徐东平审校

慢加急性肝衰竭（ACLF）是我国肝衰竭的主要类型，其病情发展迅速、预后不良、病死率较高。在我国，乙型肝炎病毒（HBV）感染是导致ACLF的主要病因，其中HBV前C（PC）/核心启动子（CP）区基因变异与ACLF的发生密切相关。本文重点介绍HBV PC/CP区基本结构和功能、PC/CP区变异后生物学特性的改变、ACLF的免疫病理损伤机制、PC/CP区变异与ACLF疾病进展的临床意义等方面的研究进展。

慢加急性肝衰竭；乙型肝炎病毒；前C区；核心启动子；变异

乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）引起的传染病，HBV感染是全球公共健康问题。我国约有慢性HBV感染者9300万人，2000万慢性乙型肝炎患者[1]。HBV感染可进展为慢性乙型肝炎、肝硬化（Liver cirrhosis，LC）、肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）和肝衰竭。肝衰竭可分为急性、亚急性、慢加急性和慢性肝衰竭，其中慢加急性肝衰竭（Acute-on-chronic liver failure，ACLF）是临床最为常见的肝衰竭，是在慢性肝病的基础上出现的急性肝功能失代偿，我国的ACLF患者主要是由HBV感染所引起的[2]，ACLF为临床独特的肝病危重疾病，病情发展迅速,预后不良，死亡率高达50%～80%[3]，其具体的发病机制未完全明确,可能与以下几个方面因素相关[4]：1.宿主的免疫学因素；2.宿主的遗传易感因素；3.病毒基因变异等病毒学因素；4.病毒基因变异引起的机体免疫应答反应状态改变是肝衰竭的重要发生因素[5,6]，与肝脏病情恶化密切相关[7]。其中，HBV前C（Procore， Pre-C）/核心启动子（Core promoter,CP）区变异对病毒的转录复制和表达可产生明显影响，进而影响疾病进展，并可能在特定环境下成为ACLF的始动因素，与ACLF的发生、发展显著相关。本文将对HBV前C/CP区的结构及功能、前C/CP区变异后生物学特性的改变以及免疫学和病毒学因素对ACLF发生的影响等方面进行一系列的阐述。

1 HBV前C/CP区的基本结构及功能

HBV基因结构为部分双链的环状DNA，其基因组全长约为3.2kb。HBV DNA基因组由四个开放的读码框（Open reading frame,ORF）组成，分别为S基因（前S1、前S2及S区）、P基因、X基因、C基因区（前C及C区）。其中，前C基因区（nt1814-nt1900），为C-ORF的一部分。由29aa个氨基酸多肽组成，前C区产物的氨基酸端是非结构的信号肽，使后续的结构部分转移至内质网，前C区转录的前C mRNA形成HBeAg的前体蛋白，解脱信号肽和羧基端的一些残基后，形成分子量不等的HBeAg群体，向细胞外分泌，具有编码HBeAg的功能。CP区（nt1575-1849）包含有基本核心启动子区（BCP，nt1743-1849）和上游调控区（URR，nt1613-1742）等功能区域，其中BCP区的功能较为重要，参与调控3.5kb HBV pgRNA和preC mRNA的转录起始。pgRNA是聚合酶、逆转录和C蛋白合成的模板[8]，CP区对调控pgRNA的合成以及HBV复制中起重要的作用[9]。

HBV在复制过程中，由于HBV DNA聚合酶缺乏读码校正功能，在宿主免疫、药物等各种外界压力作用下，其相关基因也将发生各种变异，以确保其生物学优势，其中在前C/ CP区出现的变异与ACLF的发生密切相关[10]。

2 HBV前C/CP区变异后生物学特性的改变

当前C/CP区出现变异时，常伴有重要的生物学活性（包括：HBsAg、HBeAg、HBcAg、HBV DNA和启动子活性）的改变。

2.1前C区变异后生物学特性的改变前C区内含有一个发卡的ε干襻结构，ε干襻结构是病毒的包装信号，它的功能是与P蛋白结合包装前基因组RNA，引导基因组的复制。在这个茎环结构中，1850A与1904G、1855T与1899G、1858T与1896G这3对核苷酸互不配对，这是这些位点发生基因变异的重要分子基础[11]。

由Carman et al[12]首先证实，在HBV前C区中最常见的变异为G1896A，该变异可使28为色氨酸编码单位（TGG）变为终止密码（TAG），使HBeAg合成的提前终止，HBeAg的合成、表达减少。HBeAg能缓解细胞毒T淋巴细胞（Cytotoxic T lymphocytes,CTL）对细胞膜上HBcAg的攻击，当HBeAg合成或分泌障碍时，CTL容易攻击感染的肝细胞，造成严重的肝细胞损伤。此外，G1896A变异还增加HBV茎环结构的稳定性，使HBcAg的表达增加，HBcAg在肝细胞内的分布由核型转变成胞质型，增加了其对肝细胞的毒性[13]。前C区G1896A变异还能使血清γ干扰素（IFN-γ）增高，IFN-γ可诱导血管内皮细胞和单核吞噬细胞，促进产生IL-26等细胞因子诱导肝细胞凋亡[14]。因此，前C区变异后出现的HBeAg转阴在特定条件下有可能引起更严重的肝脏疾病。

本课题组任晓强[15]对958例乙肝患者，其中包括399例轻中度慢性乙型肝炎、211例重度慢性乙型肝炎和348例慢性重型乙型肝炎患者，对958例患者HBV前C/CP区序列的10个热点变异位点进行分析发现，随着病情加重，有T1753、A1762、G1764、C1766、T1768、G1862、G1896、G1899等8个位点变异频率显著增加，其中5个位点的变异发生率随病情加重呈现阶梯式上升特点，推测前C/BCP区多个位点变异的积累是慢性乙型肝炎重型化进程中的基础病毒学因素。此外，前C/BCP区多联变异和插入/缺失突变的发生率在病情加重时也明显增加，其中三联变异率随疾病加重呈逐渐升高的趋势，表明这一区域多位点变异发生频率的增加与疾病重症化进程密切相关。

2.2 CP区变异后生物学特性的改变CP区属于非编码区，包含DR1区、前C和C基因的2种mRNA起点，其对pgRNA的转录起重要的调控作用。同时，CP区为多种肝细胞核内因子的结合部位，为病毒转录、反转录和正链合成的起点，也是HBV DNA复制的重要调节区[16]。陈风娟[17]对肝细胞核因子4α（Hepatocyte nuclear factor 4α，HNF4α）与肝脏疾病研究进行了综述，对乙型病毒性肝炎患者进行肝穿刺发现：肝穿刺组织中HNF4α表达量与HBsAg，HBcAg和HBV DNA的表达量呈正相关，证明HNF4α支持HBV的复制；体外实验证实肝细胞核内因子对HBV复制的增强作用主要是通过与HNF4α结合来实现的，提示HNF4α为HBV前基因组RNA合成和病毒复制所必需，且是一个正性作用的调控因子，是病毒嗜肝性的主要决定因子。因此，当CP区出现病毒变异和肝细胞核因子高表达时，可能促使病毒基因的表达升高，使HBV DNA的复制力增强从而加速疾病重症化的进展。

BCP区内有T1753A/C、T1754C/G、T1758C、A1762T、G1764A、C1766T、T1768A等热点变异位点在ACLF患者中出现较多。其中以A1762T（亮氨酸变为蛋氨酸）和G1764A（缬氨酸变为亮氨酸）联合变异最为常见，Okamoto等首先[18]发现在BCP区中A1762T和G1764A两位点变异可形成HBeAg阴性CHB，两位点联合变异在无症状HBeAg阳性患者中很少出现；而在重症HBV患者中的变异发生率却很高，其在重症HBV发病机制中起重要的作用。功能实验显示A1762T和G1764A联合变异会使转录因子与BCP区的结合发生改变，使pre-C mRNA的转录降低从而导致HBeAg水平的下降，但不影响前基因组RNA和HBV DNA水平，可提高病毒复制力水平，使变异后的病毒复制力高于野生株[19，20]。其原因可能为：一方面CP区联合变异时与HNF-4核因子的结合能力增强，pgRNA的转录上调，促进pgRNA的衣壳化，增加HBcAg的表达，从而使病毒复制力增强[21]。另一方面，A1762T/G1764A和其他CP区内的变异，可能改变pgRNA的二级结构，从而形成松散的茎襻结构，在逆转录的过程中易被打开。最近研究发现，前CP区变异还与HBV X基因区、前S（Pre-surface）和CP区碱基的缺失、插入突变等因素密切相关。当CP区出现缺失或变异时会影响HBV的转录活性以及HB X基因区的完整性，可能与疾病重症化的进展密切相关[22]；同时，前S区发生缺失联合CP区出现的变异是预测终末期肝病的重要指标[23]。

CP区出现重要位点的变异被视为影响启动子活性及HBV DNA复制的主要因素之一[24]，且多联变异的影响要高于双联变异。本课题组王耀[25]对40例慢性乙肝患者与40例慢加急性肝衰竭患者进行分析，结果发现G1764A/C1766T/ T1768A三联变异在CHB患者中为0.0%（0/40）；在ACLF患者中为12.5%（5/40）。细胞转染结果显示：典型BCP区双联变异A1762T/G1764A病毒株的启动子活性较野生株的提高了1.67倍，复制力为野生株的1.56倍。而G1764A/C1766T/ T1768A三联变异病毒株的启动子活性为相应野生株的1.43～1.80倍，复制力为野生株的1.54～2.85倍。结果表明BCP区内的多联变异的影响高于双联变异，双联及多联变异能顺式激活下游基因转录活性的作用，从而增强病毒的复制力，随着疾病进展加重其累积变异位点明显增多[26]。

3免疫学因素对ACLF发生的影响

肝衰竭是由多种因素引起的严重肝脏损害，导致肝脏的合成、解毒、排泄和生物转化等功能发生严重障碍或失代偿，出现凝血机制障碍、转氨酶升高、黄疸、腹水和肝性脑病等为主要表现的一组临床症候群[27]。在我国，发生ACLF的主要病因是由HBV感染所引发的。ACLF的发生和发展主要受宿主免疫和病毒变异等因素的相互作用的影响。其中，病毒变异诱发的机体免疫损伤是引起肝衰竭发生、发展的重要因素[28]。

乙型肝炎病毒并不直接引起肝细胞的损伤，在人体感染HBV后，患者在受到劳累、酒精、病毒变异、肝损害药物等诱因的刺激下，通过引发人体的细胞免疫和体液免疫应答，从而激发自身免疫反应及免疫调节功能紊乱，导致病变的肝细胞产生或释放大量异常的蛋白质，进一步促进免疫损害加重，使病情不断发展。其中，HBV引发的免疫损伤以细胞免疫为主，体液免疫为辅。ACLF是机体免疫系统对HBV的过激应答反应，CTL的特异性损伤、炎症细胞因子的大量增多引起的急性炎性反应以及各种免疫活性细胞引发非特异性损伤是诱发ACLF的主要因素，机体的免疫反应决定着ACLF疾病的转归[29]。

4前C/CP区变异对ACLF发生的影响

HBV感染的结局取决于病毒、宿主和机体免疫之间的相互作用。当重要的基因区结构出现病毒变异时，这个三者之间的平衡关系被打破。前C区发生变异时可产生HBeAg阴性慢性乙型肝炎，失去HBeAg的免疫调节，CTL易诱导感染的肝细胞凋亡，加重机体免疫反应，造成肝细胞损伤；而发生在CP区的变异可使病毒的复制力增强。因此，当前C/CP区出现联合变异时，机体的免疫平衡状态被打破，可造成肝细胞在短期内大量坏死，导致病情急剧加重，出现重型肝炎甚至肝衰竭，死亡率较高[30]。

本课题组Ren等[31]对75例未发生LC的ACLF患者和328例CHB患者进行比较后分析发现：①ACLF组患者出现前C和BCP区变异率明显高于CHB患者；②HBV B基因型比C型更易发生ACLF；③当前C/BCP区出现单变异T1753V（C/A/G）,A1762T,G1762A,G1896,G1899A和三联变异A1762T/G1764A/C1766T、T1753V/A1762T/G1764A时，提示HBV B基因型与以上前C/BCP区的变异位点是预测ACLF发生的危险因素。

本课题组前期完成的研究结果表明，在793例乙肝患者中（包括325例CHB-M、170例CHB-S和298例ACLF患者），发现A1762T/G1764A与T1753V、C1766T和T1768A共存以及T1753V、C1766T、T1768A的三联变异可显著增加病毒复制力，这些前C/BCP区的联合变异常出现在ACLF患者中，其发生率明显高于CHB患者,进一步证明在前C/BCP区发生的变异位点累积增多及多联变异是增加ACLF发生率的新的危险因素；此外，BCP区A1846T出现的变异，在ACLF患者中的发生率明显高于CHB患者，推测A1846T变异可做为预测ACLF发生的另外一个重要指标[32]。

Zhang[33]对87例ACLF患者（29例ACLF-CHB、58例ACLF-LC）、52例CHB患者、51例LC患者研究也同样证明了，在CHB、LC、ACLF患者中，B基因型发生A1846T或C1913A/G变异时在ACLF患者中发生率较高；同时，多变量分析发现A1846T或C1913A/G变异是ACLF发生的独立危险因素。

Xiao[34]对322例HBV患者（包括77例ACLF、109例HCC、136例CHB）进行基因型分类及前C/BCP区变异相关分析，结果表明：B基因型为198/322（61.5%）、C基因型为124/322（38.5%）；A1762T/G1764A、A1846T和G1896A变异在ACLF患者中的发生率为（50.7%），在CHB患者中发生率为（28%），该研究同样也证明了HBV患者伴有B基因型、A1762T/G1764A、A1846T和G1896A等前C/BCP区的变异与ACLF的发生显著相关。

此外，Hu等[35]对前C/BCP区的变异与ACLF之间的关系进行Meta分析研究，其共搜索了31篇关于报道ACLF相关的文章，其中对1995例ACLF和3822例CHB患者进行比较，对前C/BCP区出现的变异位点进行统计分析后发现：T1753V、A1762T、G1764A、A1762T/G1764A、C1766T、T1768A、A1846T、G1896A、G1896A/A1762T/G1764A变异以及HBeAg阴性均有统计学意义，其发生与ACLF显著相关，推测前C/BCP区出现上述位点的变异是预测ACLF的发生和进展的重要危险因素。

5 小结

ACLF的发生是一个十分复杂的过程，由多因素共同参与，目前其具体致病机制还未完全清楚，但病毒变异和机体免疫病理损伤在HBV疾病转归中起重要的作用，即：HBV基因型、前C/CP区变异、HNF4α、免疫损伤机制与ACLF的发生和进程显著相关。当HBV出现前C区变异后，可发生HBeAg阴性CHB；CP区出现变异后可使HBeAg表达降低，病毒复制力增强，从而易于引起机体的免疫平衡状态打破，在诱发因素和（或）宿主遗传易感因素的共同作用下，可导致过强的免疫反应，进而引起严重的病理损伤，使细胞短期内大量坏死，发展为ACLF。目前，对于ACLF的治疗缺乏十分有效的治疗方法，ACLF患者的病情发展迅速、并发症较多、死亡率较高。

上述关于前C/CP区出现的重要病毒变异位点和机体免疫病理机制的研究有助于阐明ACLF的发生机制，并对临床预警分析有积极意义。此外，临床上应该重视HBV患者出现前C/CP区变异的病情变化，及早做出正确的干预和对症治疗，有效地降低ACLF患者的死亡率。

[1] 中华医学会肝病学分会和感染病学分会.慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）.实用肝脏病杂志，2011，14（2）：81-89.

[2] You SL，Rong YH，Zhu B，et al. Changing etiology of liver failure in 3916 patients from northern China:a 10-year survey. Hepatol Int，2013，7（2）:714-720.

[3] Chisari FV，Isogawa M，Wieland S. Pathogenesis of hepatitis B virus infection. Pathol Biol（Paris），2010，58（4）:258-266.

[4] Olson JC，Kamath PS. Acute-on-chronic liver failure:concept，natural history，and prognosis. Curr Opin Crit Care，2011，17（2）:165-169.

[5] Jules L，Dienstag，MD. Hepatitis B Virus Infection. N Engl J Med，2008，359（14）:1486-1500.

[6] Malik A，Singhal DK，Albanyan A，et al. Hepatitis B virus gene mutations in liver diseases:a report from New Delhi. PLoS One，2012，7（6）:e39028.

[7] Lai CL，Yuen MF. Chronic hepatitis B-New goals，new treatment.N Engl J Med，2008，359（23）:2488-2491.

[8] Orito E，Ichida T，Sakugawa H，et al. Geographic distribution of hepatitis B virus（HBV）genotype in patients with chronic HBV infection in Japan.Hepatology，2001，34（3）:590-594.

[9] B-ttcher B，Wynne SA，Crowther RA. Determination of the fold of the core protein of hepatitis B virus by electron cryomicroscopy.Nature，1997，386（6620）:88-91.

[10] Zhang D，Ma SF，Zhang X，et al. Prevalent HBV point mutations and mutation combinations at BCP/preC region and their association with liver disease progression.BMC Infect Dis，2010，10:271.

[11] 骆抗先. 乙型肝炎基础和临床. 3版.北京:人民卫生出版社，2006:78-90.

[12] Carman WF，Zanetti AR，Karayiannis P，et al. Vaccine-induced escape mutant of hepatitis B virus.Lancet，1990，336（8711）: 325-329.

[13] 徐东平. 乙型肝炎病毒的病毒学特点及其临床意义.解放军医学杂志，2009，34（6）:655-658.

[14] 李春青，荀运浩，过建春.HBV前C/BCP区变异与重型乙型肝炎相关性的研究进展.中西医结合肝病杂志，2010，20（5）: 315-317.

[15] 任晓强，许智慧，刘志国，等. 958例乙型肝炎患者HBV前C/BCP区变异检测及其意义分析.解放军医学杂志，2009，34（6）:663-665.

[16] Tu WH，Lyu Y，Zhang YM，et al. Precore/basal core promoter mutants quantification throug-hout phases of hepatitis B virus-infection by Simpleprobe. World J Gastroenterol，2015，21（21）:6639-6648.

[17] 陈风娟，王甦. 肝细胞核因子4α在肝脏疾病中的研究进展.医学理论，2013，26（5）:590-592.

[18] Okamoto H，Tsuda F，Akahane Y，et al. Hepatitis B virus with mutations in the e antigen-negative phenotype in carriers with e antibody to e antigen. Virology，1994，68（12）:8102-8110.

[19] Buckwold VE，Xu ZC，Chen M，et al. Effects of a naturally occurring mutation in the hepatitis B virus basal core promoter on precore gene expression and viral replication.V irology，1996，70（9）:5845-5851.

[20] Tang H，Banks KE，Anderson AL，et al. Hepatitis B virus transcription and replication.Drug News Prespect，2001，14（6）: 325-334.

[21] 李梵，徐东平.乙型肝炎病毒基因突变与临床疾病进展的关系.实用肝脏病杂志，2014，17（2）:210-213.

[22] Peng Y，Liu B，Hou J，et al. Naturally occurring deletions/insertions in HBV core promoter tend to decrease in HBeAgpositive chronic hepatitis B patients during antiviral therapy.Antivir Ther，2015，10:3851/IMP2955.

[23] Qu L，Kuai X，Liu T，et al. Pre-S deletion and complex mutations of hepatitis B virus related to young age hepatocellular carcinoma in Qidong，China. PLoS One，2013，8（3）:e59583.

[24] Juniastuti D，U tsumi T，Aksono EB，et al. Predominance of precore mutations and clinical significance of basal core pro moter mutations in chronic hepatitis B virus infection in Indonesia. Biomed Rep，2013，1（4）:522-528.

[25] 王耀，刘妍，许智慧，等. G1764A/C1766T/T1768A三联突变对HBV核心启动子活性的上调作用的研究.解放军医学杂志，2010，35（8）:954-957.

[26] Kitab B，Essaid El Feydi A，Afifi R，et al. Variability in the precore and core promoter regions of HBV strains in Morocco: Characteri z ation and impact on liver disease progression. PLoS One，2012，7（8）:e42891.

[27] 中华医学会感染病学分会肝衰竭与人工肝学组.肝衰竭诊治指南（2012年版）. 实用肝脏病杂志，2013，16（3）:210-216.

[28] 黄湛镰，高志良.肝衰竭的三重打击及治疗策略.内科急危重症杂志，2014，20（3）:154-156.

[29] 李晓东，徐东平.HBV相关慢加急性肝衰竭免疫病理发病机制研究进展.实用肝脏病杂志，2015，18（3）:317-320.

[30] 杨玲，曾文铤，梁增伟，等.BCP/前C及A1846T变异与HBV导致的慢加急性肝衰竭发病相关研究.热带医学杂志，2013，13（9）:1095-1097.

[31] Ren X，Xu Z，Liu Y，et al. Hepatitis B virus genotype and basal core promoter/precore mutations are associated with hepatitis B related acute on chronic liver failure without preexisting liver cirrhosis. J Viral Hepat，2010，17（12）:887-895.

[32] Xu Z，Ren X，Liu Y，et al. Association of hepatitis B virus mutations in basal core promoter and precore regions with severity of liver disease:an investigation of793 Chinese patients with mild and severe chronic hepatitis B and acute on chronic liver failure.J Gastroenterol，2011，46（3）:391-400.

[33] Zhang A，Wan Z，You S，et al. Association of hepatitis B virus mutat ions of A1846T and C1913A/G with acute on chronic liver failure development from different underlying chronic liver diseases.Hepat Mon，2013，13（9）:e12445.

[34] Xiao L，Zhou B，Gao H，et al. Hepatitis B virus genotype B with G1896A and A1762T/G1764A mutations is associated with hepatitis B related acute on chronic liver Failure. J Med Virol，2011，83:1544-1550.

[35] Hu F，Bi S，Yan H，et al. Associations between hepatitis B virus basal core promoter/precore region mutations and the risk of acute on chronic liver failure:a meta-analysis. Virol J，2015，12:87.

（收稿：2015-07-28）

（本文编辑：朱传龙）

Precore and core promoter mutations of hepatitis B virus and their roles in acute-on-chronic liver failure

Huang Pengyu，Xu
Dongping.Institute of Biochemistry and Molecular Biology，School of Laboratory Medicine，Guangdong Medical College，Zhanjiang 524000，Guangdong Province，China

Acute-on-chronic liver failure（ACLF）is common type of liver failure，with poor prognosis and high mortality.Hepatitis B virus（HBV）infection is the major cause of ACLF in China.HBV precore/core promoter（PC/CP）region gene mutation is closely related to the occurrence of ACLF.In this article，we reviewed the structure and functions，biological change by mutations of HBV precore/core promoter，and immunopathogenetic mechanisms of ACLF.

Acute-on-chronic liver failure；Hepatitis B virus；Precore region；Core promoter；Mutation

10.3969/j.issn.1672-5069.2016.02.035

国家自然科学基金资助项目（No.81271847）

524000 广东省湛江市广东医学院检验学院生物化学与分子生物学研究所（黄鹏宇）；解放军第302医院临床研究管理中心（徐东平）

黄鹏宇，男，25岁，硕士研究生。主要从事乙型肝炎病毒变异的检测与临床意义研究

徐东平，E-mail:xudongping302@sina.com