超声介导纳米基因及药物递送的研究进展

马　静综述, 杜联芳审校

(1上海交通大学附属第一人民医院松江分院超声科，上海　201699； 2上海交通大学附属第一人民医院超声科； 3同济大学附属上海市东方医院超声科; *通讯作者， E-mail:du_lf@163.com)



超声介导纳米基因及药物递送的研究进展

马静1,2,3综述, 杜联芳2*审校

(1上海交通大学附属第一人民医院松江分院超声科，上海201699；2上海交通大学附属第一人民医院超声科；3同济大学附属上海市东方医院超声科;*通讯作者， E-mail:du_lf@163.com)

纳米材料；药物递送；超声介导

纳米材料载体作为应用于当今医药领域的新宠,本身具有诸多的突出优势：对人体无害作用、无免疫源性、生物可降解性、宿主细胞范围广泛、可承载物范围广泛等，而将基因或药物用纳米材料进行包载，对许多疾病进行靶向递送实施治疗已成为目前医疗研究的热点之一[1]。

1　纳米材料的理化特性及纳米载体的制备方法

可生物降解的纳米材料具有良好的生物相容性，在体内水解酶的作用下分解而吸收，经过三羧酸循环变成终产物水及二氧化碳，经肺、肾、皮肤排泄。载体释放完毕时，载体也被同步吸收，不需取出[2]，故其被视为理想的缓释材料，应用非常广泛。现在最常用的生物降解高分子材料是聚酯类材料[3,4]，其中以聚乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA)最为重要，它是美国FDA批准用于人体的可生物降解材料，在体内被降解成乳酸和羟基乙酸，最终代谢成水和二氧化碳，对人体无毒无害[5-7]。通过PLGA可制造多种纳米微囊，包裹蛋白质和氨基酸纳米药物，基因，疫苗，抗原和生长因子等，而且改变其自身共聚物中的材料成分聚乳酸(PLA)与聚羟基乙酸(PGA)的比例，可以控制结晶性、溶解性以及材料的吸水能力，从而调节聚合物在体内降解的速率[8-10]，使其降解时间满足所包埋基因和药物的要求[11,12]。

纳米微囊的制备方法是通过所用材料、所包埋药物性质及包载要求来选择，目前多采用复乳法制备空白纳米微囊，超声乳化/溶剂扩散法及油化乳化法等方法来制备载药纳米微囊，对于DNA，siRNA及抗肿瘤药如顺铂、米托蒽醌，抗寄生虫药如戊烷脒、阿苯达唑[13,14]的包载已取得了较为肯定的研究。材料浓度，乳化剂浓度，超声照射的强度[15]，内/外水相体积比等一些因素影响纳米微囊包载药物的包封率，而包载药物的释放速度通过制备过程中纳米载体材料各组成成分的构成比和酸碱度来控制[16]。

2　纳米载体对于基因和药物的递送

纳米基因或药物递送载体本身粒径比毛细血管通路还小1-2个数量级，是红细胞的1/60-1/60 000，可以跨越许多通常的障碍，甚至可以到达细胞内，将基因或药物送到细胞或组织，从而达到良好的靶向治疗的目的[17]。由于不同组织肿瘤对不同粒径大小纳米载体的通透性不同，造成纳米载体递送系统被动靶向性的差异，肾脏易代谢清除粒径小于20-30 nm的纳米载体，而粒径为30-150 nm的纳米载体易于聚集在骨髓、心脏和肾脏，肝脏和脾脏中容易聚集粒径为150-300 nm的纳米微囊[18]。

通常纳米载体的递送过程都会受到不同因素影响，大多纳米微囊表面携带有大量负电荷，这些电荷不但影响其与一些基因药物结合，同时限制其与许多肿瘤细胞亲和[19]，更令人担心的是，进入体内的纳米载体会被机体视为异物，易于被体内肝和脾中的单核吞噬细胞系统和网状内皮系统所吞噬[20]。科研工作者发现，应用单甲醚聚乙二醇(mPEG) 对于PLGA进行修饰，一方面赋予PLGA-mPEG复合物躲避体内免疫系统清除的特性[21,22]，延长纳米微囊在体循环停留时间，另一方面屏蔽了PLGA表面的部分负电荷，提高纳米载体对于基因的包载量，再加上聚左旋赖氨酸(PLL)结合后能明显增加PLGA的表面正电性，PLL的氨基又能与负电性的DNA/siRNA发生静电相互作用，进一步提高了基因包载量而改善了基因的转染效果[23]。

基于大多数的肿瘤细胞或肿瘤血管内皮细胞表面具有异常高表达的特异性抗原或受体，在正常组织细胞的表面并不表达或低水平表达，近来科学家们已根据肿瘤细胞和正常细胞表面的抗原或受体表达的程度不同以提高主动靶向递送效率进行了广泛的研究[24,25]。整合素αvβ3是在多种恶性肿瘤细胞表面或肿瘤组织新生血管内皮细胞上有高水平表达的受体，而正常组织的细胞或成熟血管内皮细胞则无表达或几乎不能被探及，含精氨酸-甘氨酞-天冬氨酸(Arg-Gly-AsP，RGD)序列的配基类似物修饰mPEG-PLGA-PLL聚合物材料可作为拮抗剂与整合素αvβ3进行竞争性结合，从而实现纳米载体主动靶向递送[26]。Yoo等[27]已成功用叶酸修饰PLGA-mPEG，然后包载阿霉素制备载药胶束。体外实验结果表明，与没有用叶酸修饰的载药胶束相比，用叶酸修饰的载药胶束能明显增强人口腔鳞癌KB细胞对其摄取。

由于纳米载药微囊递送效率偏低而不能满足治疗的需要是近些年来国内外纳米专家所共同面临的难题。Fuente等[28]报道了由生物黏附多聚糖舌骨酸和CS合成的一种新的DNA纳米载体可以将质粒DNA递送到角膜和结膜细胞，转染效率约15%。Bishop[29]报道纳米微囊很难穿越像玻璃体腔内由充满蛋白多糖桥接而成的胶原纤维组成网格屏障，所以单纯的纳米微囊对于一些必须穿越这样的屏障的难治性视网膜疾病的治疗遇到了巨大的瓶颈，而我们熟知的“癌中之王”胰腺癌，由于其特殊的病理解剖结构，靶向纳米微囊递送也遇到巨大阻力，研究者报道[30]，正常胰腺周围为疏松结缔组织，无明确被膜结构，胰腺小叶间隙是胰腺血液、神经、淋巴出入胰腺实质的通路，其组织结构为疏松结缔组织，与胰腺周围的疏松结缔组织和腹膜后疏松结缔组织相连续，而胰腺癌组织周围为致密结缔组织，离病变胰腺组织越近程度越明显，而小叶间隙变化为大量纤维组织及淋巴细胞浸润，单纯的载药纳米微囊很难进入到胰腺癌组织中去，作为非病毒性载体的纳米微囊，与其他载体一样存在转染效率偏低的缺点，如何进一步增加纳米粒子的药物递送效率将是产生更好治疗效果的关键。

3　超声靶向微泡破裂对于纳米递送系统作用机制及应用

3.1超声靶向微泡破裂(ultrasound targeted microbubble destruction,UTMD)作用机制

UTMD作用机制包括：目前比较公认的“细胞打孔”效应，它是指超声辐照微泡破裂后产生的微环流、微射流致使细胞膜产生微米级或纳米级的瞬时孔，纳米微囊通过声孔进入细胞进行基因及药物递送[31-33]；此外超声的作用使细胞内产生氧自由基，激活了囊胞介导的细胞膜修复转运机制，通过增加胞吞作用促进纳米微囊的细胞摄取从而增加了细胞膜的通透性，促进纳米微囊的细胞摄取[34,35]。受超声辐照区域吸收了超声波能量使局部瞬时温度升高影响了细胞膜磷脂双分子层的流动性，改变了细胞膜的通透性[36]。尽管超声和微泡递送的机制尚没有完全搞清楚，UTMD仍在增强眼、肿瘤、骨骼肌、心脏、骨髓干细胞等许多领域药物和基因的递送方面发挥了较为确定的作用[28,37-43]。

3.2UTMD介导纳米微囊递送载体实施治疗

作为卵巢癌一线治疗药物的紫杉醇，治疗效果一直以来因其严重的不良反应而受到影响，Liu等[37]发现在UTMD介导之下，枝接LHRHa 包载PTX的微囊载体，能有效地增强抗胰腺癌的治疗效果。Hauff等[38]利用充气纳米粒包载pU T651-MB质粒联合UTMD治疗大鼠CC531(结肠癌细胞)肝肿瘤,发现基因表达明显增加，应用抑癌基因p16质粒治疗荷Capan1肿瘤(人胰腺癌细胞株)，结果显示UTMD可使治疗基因定向释放，有效抑制肿瘤生长。杜晶等[39]报道超声和/或微泡可以安全有效地增强载siRNA纳米粒子递送到RPE细胞，在保持较高细胞摄取率的同时，可有效降低纳米粒的剂量，通过大鼠体内及体外试验得出了超声辐照增强载Cy3-siRNA纳米粒子递送最佳参数设置条件。Ling等[40]通过UTMD介导间充质干细胞干预心肌微循环的试验研究，观察左室后壁心肌梗死区，在优化后UTMD条件作用下心肌微循环明显改善。Chappell等[41]证实UTMD可以有效地使载成纤维细胞生长因子-2的PLGA纳米粒子通过血管沉积在大鼠的肌肉组织。Hosseinkhani 等[42]研究发现利用经聚乙二醇(PEG)修饰的阳离子葡聚糖联合超声照射可将质粒DNA高效、靶向地传输至纤维肉瘤。Rapoport等[43]制备载药多聚物微球和纳米微泡，利用UTMD介导多柔比星对乳腺癌移植瘤进行治疗，发现静脉注射的载多柔比星微球可被超声辐照释放出来并选择性渗透至肿瘤间质中,致使肿瘤组织萎缩。

利用UTMD靶向纳米递送系统来递送药物，在提高药物在体内靶组织的聚集浓度、增强局部药物效能同时，减少全身用药剂量及纳米微囊用量，而且通过对药物进行包载，还可以浓缩药量和减少给药的次数[44]，尤其对于难以攻克的肿瘤的治疗是一种有潜力的治疗方法。

4　纳米药物载体诊疗一体化

UTMD介导靶向纳米微囊载体抗肿瘤治疗的关键过程能够被可视化将是实现特异性的肿瘤诊疗一体化的关键，以SonoVue为代表的脂质微泡是目前最常用的超声对比显影剂，其作为一种优良的血池示踪剂，显像效果已经不言而喻。它对于人体完全无毒、无副作用，在临床广泛应用，到目前为止，在肝脏、肾脏、甲状腺、乳腺、心脏及其血管等组织应用已经比较成熟[45-48]，尤其对于肿瘤的微循环的显示和分析具有独特的优势。目前的研究报道[49]，微米级超声造影剂通过微泡的共振作用致非线性谐波而产生超声造影显像，同时在安全的超声条件设置的情况下，微泡破裂可以产生可逆性的声孔效应，帮助药物从血液进入到细胞间质以及细胞核，同时增强血管通透性，利于药物在组织沉积。各种靶向的配体也可以连接到微泡的表面，而形成微泡的特异性显像。这种技术也非常有发展潜力，但是微米级超声造影剂，是在有血液灌注的情况下，二次谐波而产生增强的对比成像效果，在无灌注区则几乎没有对比显像。作为乏血供的胰腺恶性肿瘤，常规的微米级超声造影剂不能满足其显像诊断的要求，新型的纳米级超声造影剂的研发是超声造影技术发展的趋势。超声纳米造影剂具有不同于微泡造影剂的特点[50-52]：外壳较坚固，在超声振荡显像的同时，纳米粒本身不容易变形，空气中暴露及血流的剪切力作用下不易破裂，耐热性质相对稳定，抗压能力较强，同时它也具有一些不足的地方：不像微泡有自然的较强回声，背向散射能力偏差，因此需要一个较高浓度的蓄积才可以达到比较好的显像效果，但它包载和携带药物进行治疗的能力较强，因此靶向多功能纳米诊疗体针对难治型肿瘤等疾病不失为一种具有良好发展前景的新辅助诊疗方法。

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国家自然科学基金资助项目(81271596,81171352,81501483)；上海市松江区中心医院优秀医疗人才培养计划资助项目；松江区科技攻关资助项目

马静,女,1975-07生,博士,副主任医师,E-mail:majing0709@163.com

2016-06-10

R318.08

A

1007-6611(2016)08-0779-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.08.023