激发子诱导果实采后病程相关基因的研究进展

陈亮亮,张红印,孙　伟,周永霞,李丹丹,周　静

(1.江苏大学生命科学研究院,江苏镇江 212013;2.江苏大学食品与生物工程学院,江苏镇江 212013;3.镇江市粮油质量检测所,江苏镇江 212013)



激发子诱导果实采后病程相关基因的研究进展

陈亮亮1,张红印2,*,孙伟3,周永霞2,李丹丹2,周静2

(1.江苏大学生命科学研究院,江苏镇江 212013;2.江苏大学食品与生物工程学院,江苏镇江 212013;3.镇江市粮油质量检测所,江苏镇江 212013)

果实采后因病原菌的侵染而造成的损失非常巨大。在控制果实采后病害的研究中,利用激发子来诱导果实产生抗性,逐渐成为果实采后病害防治中一种安全高效的保鲜方法,是当前采后病理学、生理学的研究热点。根据激发子的来源可分为生物型和非生物型,据报道它们可以诱导宿主表达病程相关蛋白而对病原菌产生抗性。病程相关蛋白,是由宿主自身病程相关基因转录而表达的,报道的病程相关蛋白基因在很多水果中被定位、克隆,为具体地认知某一个PR基因提供了有力依据。但果实采后PR基因并不是一个基因在起作用,是整体而系统的作用,它们具有遗传特性,并且受到各种因子的调控,因此系统研究果实采后病程相关基因备受重视。随着RNA高通量测序技术在转录组学中的应用,从转录水平上来研究整个PR基因mRNA转录,从而显示某些PR基因上调或下调。本文综述了激发子对PR基因诱导的研究进展,以及转录组学技术在果实采后PR转录水平上的应用。

激发子,诱导抗性,病程相关蛋白,病程相关基因,转录组学

当前,随着植物诱导抗病理论和技术的进步,诱导抗性逐渐成为果蔬采后病害防治中一种安全高效的保鲜方法,是当前采后病理学、生理学的研究热点,并具有良好的应用前景[1-2]。在控制果实采后病害的研究中,利用激发子诱导果实抗性的研究日益增多,说明激发子诱导抗性已成为一种切实有效、可行的防治方法,在果实受到侵袭时能启动自身的防卫系统,增强抵抗能力,这与化学杀菌剂相比,低毒、甚至无毒,并且可以抑制多种病害,具有持续、稳定等优点[3]。能够诱导植物抗病性的因子根据其来源可以分为两大类:生物型和非生物型激发子[4]。据报道,当植物受到不同激发子刺激、胁迫时,植物自身防御病程相关基因(pathogenesis-related genes PRs)被诱导表达,导致病程相关蛋白的积累,从而表现出抗病性,这被证实是诱导植物产生抗性的重要生化机制之一[5]。

近年来,随着分子生物学的发展,果实采后的研究也进入到了新的阶段,比如王清等[6]研究了果实蛋白质组学的实验方法;另外,朱凯凯等[7]阐述基因组学在苹果中的应用。据报道,Ren等[8]在樱桃番茄中克隆了的PR-5基因,Liu jia等[9]克隆苹果中的PR-8和PR-5并以Pichia pastoris为载体研究证实了PR-8表达产物的活力。在植物受到胁迫时,会诱导一系列基因表达水平的改变,路来凤等[10]通过实时定量PCR验证了13个植物病程相关的基因其中有8个基因表达量上调。病程相关基因直接表达产物-病程相关蛋白(pathogenesis-related proteins)是果实受生物或非生物胁迫诱导产生并积累的一类蛋白质总称,是果实抗性体系的重要组成部分,可在体外表现出一定的抗菌作用[11]。目前,有关采后果实PRs蛋白的相关研究主要集中在具有抗真菌活性的病程相关蛋白家族1(PR-1)、β-1,3-葡聚糖酶(PR-2)、几丁质酶(PR-3、PR-4、PR-8、PR-11)、类甜蛋白(PR-5)、具有类核酸酶活性的PR-10、非特异性脂质转移蛋白(PR-14)等[11]。这些蛋白都是在基因表达水平上体现出来的,某些基因表达量的上调与下调又受到转录水平的影响,因此,转录组学的应用将会给采后生防在分子水平上带来新的发展。目前,在采后生防的研究中分子水平的研究还处于起始阶段,王金花等[12]详细地阐述了转录组学技术在果实采后衰老过程中的研究进展,说明了通过转录组测序技术可以揭示果实采后一系列的分子机制,应用前景广阔。

1　激发子的诱导抗性作用

激发子原本是指一类能激活宿主植物产生防卫反应的特殊化合物,本文中所阐述的激发子根据其种类的不同将其分为生物和非生物的激发子,据报道,两种激发子都能够诱导果实采后的抗性[4]。生物激发子主要是一些生防菌,许多生防菌都具有诱导果实产生抗性的功能可以有效抑制病原菌的生长,其中尤以酵母拮抗菌的应用前景最好[1]。目前已商用的生防制剂(BioSave 和Aspire)可以有效地控制梨采后的褐腐病和柑橘果实采后青霉病等采后病害的发生[13],用酵母拮抗菌处理采后果实,可以增强果实自身的抗性,从而抵抗病原菌的入侵[14-15],相比于化学杀菌剂来说具有安全有效,无药物残留的优点。植物组织对拮抗微生物存在感知,这种感知可以诱导寄主产生多种抗性相关响应,进而提高了植物自身的免疫力并间接的减少病原菌侵染[16]。因此,果实采后病害的生物防治不仅仅是拮抗微生物与病原菌之间的简单对抗[17],诱导抗性也是重要的一个环节。酵母拮抗菌能够诱导果实产生多种生理生化的防御反应包括:植保素的积累[18];结构上的变化及障碍物的沉积[19];诱导β-1,3-葡聚糖酶、几丁质酶活性的升高[20];合成乙烯等[18]这些物质的积累或变化通过不同的抑制机理控制了果蔬采后病害的发生。范青等[21]的研究发现接种拮抗菌季也蒙假丝酵母和膜璞毕赤酵母可刺激桃果实伤口处几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶的产生,这两种酶能够水解霉菌细胞壁,说明在拮抗菌诱导下几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶的酶活性提高,结果与对照相比,接种拮抗菌的处理组显著抑制桃果实软腐病的发生,同时也表明酵母菌作为生物型激发子能够诱导宿主相关抗性酶的表达来抑制采后病害的发生。

非生物型激发子包括物理性激发因子和化学性因子。物理因子如热处理[22]、紫外线照射[23]、β-射线[24]、辐照[25]、热蒸汽处理和CO2[26]。用于果实抗病的化学性因子有水杨酸[27]、β-氨基丁酸[28]、茉莉酸甲醋[29]、吲哚-3-乙酸[30]、2,6-二氯异烟酸和可溶性钙盐(Ca)等[31]。研究证明,利用化学激发子诱导果实抗性效果显著,例如,水杨酸作为一种重要的内源性信号分子,可以诱导特定的抗性生理反应以及抗性基因的表达,如几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶和过氧化物酶等PR蛋白[32];又如β-氨基丁酸处理不仅可以有效的在体外抑制扩展青霉的孢子萌发和芽管伸长破坏细胞膜造成蛋白和糖类的渗漏,而且能显著提高苹果的抗性酶活性,抑制苹果青霉病的发生[33]。

总之,在生物和非生物型激发子的诱导下,果实自身的抗性相关酶的表达,另外果实体内相应的抗性相关基因同时也会受到激活或抑制,因此,对这些抗性相关基因的鉴定和克隆将会促进采后生防的分子机制的研究和发展。

2　诱导的病程相关基因

植物受到病原菌侵染或其他因子刺激后,会通过一系列信号转导途径快速激发植物的抗性反应,信号转导的一个主要目标是细胞核,末端的信号将转录激活抗性相关的基因,继而合成积累相关蛋白[34]。目前研究的病程相关基因家族主要包括:PR-1,PR-2,PR-3,PR-4,PR-5,PR-8,PR-10,PR-11和PR-14基因等。侯丽霞[35]等利用同源克隆法获得葡萄病程相关基因PR-1,研究了霜霉病菌和低温等生物与非生物的逆境激发子对葡萄叶片VvPR1相对表达量,通过实时定量PCR实验,其结果表明VvPR1可响应多种胁迫,如霜霉病菌、低温、干旱及盐均可上调其表达从而证实了这些体外激发子能够诱导病程相关基因的表达。Jean M Bonasera等[36]研究了苹果不同组织中4个PR基因,PR-1a,PR-2,PR-5,PR-8的诱导表达情况,其结果表明苹果幼苗在Erwinia amylovora.诱导处理24、48 h后,PR-2,PR-5,PR-8基因显著上调,但是PR-1a基因表达量没有增加。另外,他们还研究了这四个基因在苹果根部组织的表达量并没有增加,说明在不同组织中,不同的PR基因在相同诱导条件下,基因表达量是不同的。Wang Yu-Ying等[37]研究了植酸(SA)和乙烯利(ethephon)两种体外激发子对番茄抗性要到的影响,其中植酸处理2 d后PR-1基因表达量逐渐升高,并显著降低了病害的发生;乙烯利处理的番茄和对照相比同样有着较低的病害发生率,同时通过半实时定量PCR发现PR-2,PR-3被诱导表达,但对PR-1无影响,说明有些病程相关基因在同一种激发子处理下会有不同的表达,从分子角度来说,可能是某些激活因子由于激发子的刺激宿主细胞转导信号被阻遏,而导致相关基因表达被抑制,另外的一些激活因子被加强,就导致基因表达量上升。因此,这些相关基因的表达变化在一定程度上说明此采后病害防治的分子机制还需要更多的研究。Guo Jun 等[38]在研究了茉莉酸酯和拮抗酵母 Cryptococcus laurentii 对抑制柑橘病害控制影响时,发现当茉莉酸酯和拮抗酵母结合使用时,其PR-5的表达量显著高于单独处理和对照处理,说明了PR-5基因能被诱导并且表达蛋白从而产生宿主抗性。Ashraf El-kereamy等[39]曾在李子的抗性反应中研究了PR-10基因,证实了经病原菌Monilinia fructicola处理后PR-10基因表达量上调。这些病程相关基因的研究,给果实采后病害的抑制机制研究提供了有力的证据,也提供了可以参考的研究方法,然而就整个系统的而言,某个基因的研究不能代替所有基因的研究,因此,随着转录组学技术的应用和发展,研究在采后生防中宿主被诱导的抗性基因的整体变化成为一种可以实现的技术,具有很大的发展潜力。

3　利用转录组学技术研究果实采后病程相关基因动态变化

转录组(transcriptome)是连接基因组的遗传信息与蛋白质的纽带,转录组水平的信息调控是目前已知的最重要也最为广泛的生物调节方式之一[40]。已有的资料显示,基因的诱导表达都是在转录水平上[41],而且当前随着RNA高通量测序技术在转录组学上的应用和发展[42],果蔬采后分子生物学的研究进入了一个新的方向。转录组不再遵循单个基因的研究模式,而是将分子生物学的研究带入了一个高速发展的时代[43],它与基因组不同,基因组具有静态实体的特点,而转录组同时受内源和外源因子的调控,反映的是生物的特定器官、组织在特定的发育、生理状态下所有基因的表达水平,因此,可以用转录组来比较不同组织或不同生理条件下基因水平的表达差异,从而研究生理功能相关的基因[44]。另外,作为一种整体的研究方法,转录组可以提供特定状态下特定细胞、组织的全部表达信息,再与生物体的基因组对比,从而推测一些未知基因的功能,并进一步揭示其调节因子的作用机制[12]。最近的文献道中,Lu Laifeng等[10]利用转录组学的技术研究了Rhodosporidium paludigenum酵母处理柑橘后,各类基因表达水平的变化情况,其结果表明经拮抗酵母处理后,柑橘中编码β-1,3葡萄糖酶,几丁质酶,苯丙氨酸解氨酶等PR基因表达量明显上升。另外,Jiang li等[45]利用转录组分析揭示了不同长度的黄瓜中微管相关基因的作用,通过差异基因分析,发现了3955个差异基因,其中2368个上调,1578个基因下调,再通过RT-PCR来验证转录组,其结果证实了转录组所发现的差异基因与实际数据高度统一,说明了微管相关基因在较长的黄瓜中被激活了。因此,在激发子处理采后果蔬的研究中,转录组学的运用将会成为新的手段来研究采后生防的分子机制。

4　研究存在的问题与应用前景展望

目前关于果实中抗性基因表达机制研究的不多,大多数文献都集中于对植物抗性基因的报道,但果实中抗性基因和植物本身的抗性可能会有不同差异的。大量的研究表明[1],诱导抗性作为控制果实采后病害的生物技术,在实验室和田间都有着广泛的应用前景。但是诱导抗性的机理十分复杂,而且各种不同的果蔬又存在较大的差异,就更增加研究的难度。因此要真正使得诱导抗性能应用于生产实践,必须要更加深入地探索其产生的机制,在诱导抗性中还有很多的问题需要进一步明确[1],如:哪些蛋白参与了诱导抗性的反应？这些蛋白在基因水平上是如何变化的？这些抗病相关基因的基因序列是什么？生物激发子与非生物激发子诱导抗性的机理有何异同？生物激发子与病原菌的相互作用机制是怎样的？如何利用模式果实和模式病原菌及模式生防菌从蛋白质组学、转录组学、代谢组学及功能基因组学等组学技术水平上探讨果实诱导抗病机制？转录组学检测后,如何系统来分析PR基因以及调控PR基因的转录因子？如何从系统生物学和整合植物学的角度分析诱导抗病机制？这些问题的阐明将会对采后生防的研究产生重要影响,从开始的生理学水平研究到细胞水平的研究,再到分子水平的研究,为建立起一个完整采后果蔬生防系统奠定了理论基础。

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Review on the induced pathogenesis-related genes in the postharvest fruits by elicitors

CHEN Liang-liang1,ZHANG Hong-yin2,*,SUN Wei3,ZHOU Yong-xia2,LI Dan-dan2,ZHOU Jing2

(1.Institute of life Science,Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China;2.School of Food and Biological Engineering,Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China;3.Institute of Zhenjiang Grain and Oil Quality Testion,Zhenjiang 212013,China)

Postharvest diseases of fruits caused by fungal pathogen infection resulted in significant economic losses.In the study of postharvest diseases control of fruits,the resistance of fruits induced by the elicitors had gradually become a safe and efficient method,which is the current research hotspot on postharvest pathology and physiology.Elicitors could be divided into biotic and abiotic elicitors according to their origin.Moreover,pathogenesis-related proteins of fruits could be expressed by elicitors induction,which made fruits produce resistance to the fungal pathogens.Pathogenesis-related proteins were transcripted and expressed by pathogenesis-related genes of fruits that were located and cloned in many fruits in some reported articles,which afforded clear evidences of certain PR genes in particularly.However,it was noted that not single gene worked in postharvest fruits,but integrated and systematic genes.They were known to have the genetic property and regulated by various factors.Therefore,the study of PR genes in postharvest fruits had been given important research focus.As RNA high-throughput sequencing technologies are applied in the transcriptome study,the global PR genes on the transcriptional level were researched,which showed that some genes may be up or down.This article highlighted the inductive progress on PR genes and the transcriptome technology applied on transcriptional level of PR genes in postharvest fruits.

elicitors;induction resistance;pathogenesis-related proteins;pathogenesis-related genes;transcriptome technology

2015-10-14

陈亮亮(1989-),男,硕士研究生,研究方向:生物化学与分子生物学，E-mail:dongchu2011@126.com。

张红印(1972-),男,博士,教授,博士生导师，研究方向:食品生物技术，E-mail:zhanghongyin126@126.com。

江苏省农业科技自主创新资金项目(CX 151048);江苏省科技计划项目(农业)(BE2014372);镇江市科技计划项目(农业科技支撑)(NY2013020)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)09-0384-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.068