正交试验优化紫荆果总黄酮提取及其抗氧化性

陈　园郑州大学信息工程学院，河南郑州450001



正交试验优化紫荆果总黄酮提取及其抗氧化性

陈园
郑州大学信息工程学院，河南郑州450001

摘要:为筛选紫荆果总黄酮的最佳提取工艺条件，研究紫荆果总黄酮提取液对羟自由基（·OH）清除活性，本文采用乙醇浸提法提取紫荆果中总黄酮，考察乙醇浓度、料液比、浸提温度、浸提时间四个单因素对紫荆果总黄酮提取率的影响，设计L9（34）正交实验确定最佳提取工艺条件。与二丁基羟基甲苯（BHT）对照，初步探究紫荆果总黄酮对羟自由基的清除活性。结果显示，紫荆果总黄酮的提取率在料液比1.5:60 g/mL，浸提时间2.5 h，温度80℃，乙醇浓度75%条件下为2.910%。对羟自由基清除活性高于同浓度的BHT，且随浓度升高而增大。

关键词:紫荆果；总黄酮；提取率；抗氧化性

黄酮类化合物是一类多酚类物质，在自然界中广泛分布，属于植物次级代谢产物[1]。它是大多数自由基的清除剂[2]，有较强的抗氧化活性[3]，具有抗菌、消炎、清热解毒、镇静、利尿等作用[4]。黄酮类化合物安全、无毒，在医药、食品加工等方面已被广泛应用[5]。

紫荆（Cercis chinensis Bunge），属豆科植物，因“其木似黄荆而色紫，故名。又名，满条红、乌桑、箩筐树、紫金盘、扁头翁。根皮（紫荆根皮）、木部（紫荆木）、花（紫荆花）、果实（紫荆果）供药用，其树皮和木材可入药，具有活血行气、清热解毒、消肿止痛等功效。紫荆花可用于治疗风湿骨痛、鼻中疳疮。紫荆果可治疗咳嗽[6]。研究发现，紫荆含有丰富的黄酮类化合物[7]。目前为止，已有从紫荆花和紫荆皮中提取总黄酮的研究，尚未发现有关紫荆果中总黄酮的研究报道，本研究对紫荆果中总黄酮的含量进行了测定，并以总黄酮得率为考察指标，优化其醇沉提取工艺，并初步探究提取物的抗氧化性质，即对羟自由基的清除活性，为紫荆在医药及食品等领域的应用提供数据参考。

1　材料与仪器

紫荆果，采集于郑州人民公园，洗净，烘干，粉碎（备用）。

无水乙醇、芦丁、二丁基羟基甲苯、水杨酸、氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠、硫酸亚铁、双氧水、氯化铁。均为市购，优级纯。

CP214C电子天平（德国赛多利斯）、722N可见分光光度计（上海光学仪器厂）、SHSG-3050型高速多功能粉碎机（上海硕光科技有限公司）、202-0A电热恒温干燥箱（北京金志业仪器设备有限责任公司）、HH.S11-Ni4电热恒温水浴锅（北京三二八科学仪器有限公司）。

2　实验方法

2.1芦丁标准曲线的绘制

准确吸取0.2 mg/mL的芦丁标准液0.00 mL、2.50 mL、3.50 mL、4.50 mL、5.50 mL、6.50 mL分别置于50 mL容量瓶中，各加入5%亚硝酸钠溶液0.40 mL，摇匀，静置6 min；加10%硝酸铝溶液0.40 mL，摇匀，静置6 min；加4%氢氧化钠溶液5.00 mL，用浓度为70%的乙醇溶液定容至50.00 mL，摇匀，静置10 min。在510 nm波长处以试剂空白为参比测定吸光度，绘制标准曲线得回归方程，A＝-0.0053＋0.2458C，R2＝0.99904。

2.2紫荆果总黄酮的提取

将紫荆果洗净，干燥至恒重，磨碎，过40目筛。准确称取2.0000 g的紫荆果粉末，用乙醇溶液做提取剂，水浴浸提，提取液过滤，用相同浓度的乙醇溶液洗涤并定容至50 mL容量瓶中，即得总黄酮提取液。

用分光光度法在510 nm波长处测紫荆果提取液的吸光度，按下式计算总黄酮提取率：

式中：V1为第二次定容后提取液的体积50 mL；V2从母液中量取的提取液体积0.50 mL；C为提取液中总黄酮浓度；M为样品（紫荆果）质量。

2.3紫荆果中总黄酮的提取单因素试验

2.3.1乙醇浓度对总黄酮提取率的影响准确称取2.000 0 g的紫荆果粉末，固定料液比为2:60，改变提取剂乙醇浓度分别为55%、60%、65%、70%、75%、80%，在80℃恒温水浴中浸提2 h，将提取液冷却至室温过滤、洗涤、合并提取液和洗涤液，并用与提取剂相同浓度的乙醇溶液在50 mL容量瓶中定容。在510 nm波长处测其吸光度，做3组平行试验。将吸光度的平均值代入线性回归方程，计算提取液中总黄酮浓度和紫荆果中总黄酮提取率，选择较佳的提取剂浓度。

2.3.2料液比对总黄酮提取率的影响准确称取2.000 0 g的紫荆果粉末，固定提取剂乙醇的浓度为70%，提取温度80℃，提取时间2 h，改变料液比分别为：1.0:60，1.5:60，2.0:60，2.5:60，3.0:60，以总黄酮提取率为指标，考察料液比对紫荆果总黄酮提取率的影响。

2.3.3浸提温度对总黄酮提取率的影响准确称取2.000 0 g的紫荆果粉末，固定提取剂乙醇浓度为70%，料液比为2.0:60，提取时间2 h，提取温度分别为50℃、60℃、70℃、80℃、85℃、90℃，以总黄酮提取率为指标，考察提取温度对紫荆果总黄酮提取率的影响。

2.3.4浸提时间对总黄酮提取率的影响准确称取2.000 0 g的紫荆果粉末，固定提取剂乙醇的浓度为70%，料液比为2.0:60，提取80℃，浸提时间分别为1.5 h、2 h、2.5 h、3 h，以总黄酮提取率为指标，考察提取时间对紫荆果总黄酮提取率的影响。

2.4紫荆果总黄酮最佳提取工艺优化

在单因素试验结果基础上，以黄酮提取率为综合考察指标，选定料液比、浸提时间、浸提温度、乙醇浓度4因素3水平，设计L9（34）表进行正交试验，优化紫荆果中总黄酮提取工艺条件。

2.5总黄酮对羟自由基的清除作用

参考Fenton反应体系，加入不同体积的总黄酮提取液，在510 nm波长处测定吸光度[8]。扣除提取液的本底吸收。按下式计算提取液中总黄酮对羟自由基的清除率，并以BHT（二丁基羟基甲苯）为对照，比较两种抗氧化剂对·OH的清除活性。

式中：A0为空白对照溶液吸光度；Ax为提取液吸光度；Ax0为不加H2O2提取液的本底吸光度。

3　结果与分析

3.1紫荆果中总黄酮提取单因素实验及结果分析

3.1.1乙醇浓度对总黄酮提取率的影响乙醇浓度对总黄酮提取率影响见图1。

由图1可知，乙醇浓度在55%～70%之间，吸光度值逐渐增加，乙醇浓度在70%～80%之间，吸光度值逐渐降低。实验结果表明，当乙醇浓度为70%时，吸光度值达到最大，总黄酮提取率最高。即紫荆果中提取总黄酮，提取剂乙醇的最佳浓度为70%。

图1　乙醇浓度对总黄酮提取率的影响Fig.1　Effect of ethanol concentrations on the extraction ratio of flavonoids

图2　料液比对总黄酮提取率的影响Fig.2　Effect of solid-liquid ratio on the extraction ratio of total flavonoids

3.4.2料液比对总黄酮提取率的影响料液比对总黄酮提取率影响见图2。由图2可知，料液比为2.0:60 g/mL时，测定提取液的吸光度值最大，即总黄酮提取率最高。

3.4.3浸提温度对总黄酮提取率的影响浸提温度对总黄酮提取率影响见图3。

由图3可知，在50℃～80℃之间，总黄酮提取率随温度升高而增加，浸提温度高于80℃，总黄酮提取率随着温度升高而降低，可能是由于提取物的热不稳定性，温度升高引起提取物热分解增加。

3.4.4浸提时间对总黄酮提取率的影响浸提时间对总黄酮提取率的影响见图4。

图3　浸提温度对总黄酮提取率的影响Fig.3　Effect of temperatures on the extraction ratio of total flavonoids

图4　提取时间对总黄酮提取率影响Fig.4　Effect of leaching times on the extraction ratio of total flavonoids

由图4可知，总黄酮提取率开始随着时间延长而增加，当时间超过2.0 h后，总黄酮提取率不再增加，甚至随着时间延长而降低。探究其原因可能是随着时间延长提取剂乙醇的挥发损耗。实验结果显示紫荆果中总黄酮提取的较佳浸提时间为2.0 h。

3.5正交实验及结果分析

因素水平见表1，正交实验结果见表2。

表1　L9（34）正交实验因素与水平设计Table 1 Factors and levels in the orthogonal test

表2　正交实验结果Table 2 The result of the orthogonal test

从表2可以看出，本实验中A、B、C、D四个单因素的主次关系是C＞B＞A＞D，即C（浸提温度）为最重要的因素，其次是B（浸提时间），再次是A（料液比），D（乙醇浓度），影响最小。正交实验结果显示，以总黄酮提取率为考察指标，最优实验条件组合是A1B3C2D3。即料液比为1.5:60 g/mL，浸提时间为2.5 h，浸提温度为80℃，提取剂乙醇浓度为75%。

按照正交实验所确定的最佳提取条件进行验证性实验，做三次平行实验，计算得到紫荆果中总黄酮提取率为2.910%。

3.6紫荆果中总黄酮对羟基自由基的清除作用

紫荆果中总黄酮对羟基自由基的清除实验结果见图5。

图5　紫荆果总黄酮对羟基自由基的清除率Fig.5　The rate of hydroxyl radicals scavenged by flavonoids in Cercis chinensis Bunge fruit

由图5可知：紫荆果中的总黄酮提取液对羟基自由基（·OH）有清除能力，随着提取液浓度增加，清除率也逐渐增加。当加入与提取液相同体积的同浓度BHT情况下，紫荆果中的总黄酮提取液对羟基自由基（·OH）的清除率要高于BHT（二丁基羟基甲苯）对羟自由基（·OH）的清除率。

4　讨论

本论文利用乙醇单次浸提紫荆果中总黄酮，采用分光光度法测得总黄酮含量为2.910%。与文献中报道的通过醇沉法提取纯化紫荆花中黄酮类化合物，测得总黄酮回收率为7.32%[8]。提取液的抗氧化实验结果显示，紫荆果中总黄酮对羟自由基有较强的清除活性。紫荆果与花、皮一样[9]，同样具有较高的利用价值，有待开发。

5　结论

紫荆果总黄酮最佳提取条件为：料液比1.5:60 g/mL，浸提时间2.5 h，浸提温度80℃，提取剂乙醇浓度75%。在此条件下总黄酮提取率可高达2.910%。

本文还对紫荆果总黄酮提取液抗氧化性质做了初步探究，将紫荆果中的总黄酮提取液和BHT对羟自由基（·OH）清除活性作了比较。结果显示，紫荆果提取液对羟基自由基（·OH）的清除能力略高于BHT（二丁基羟基甲苯）。

参考文献

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Flavonoids Extracted from Cercis chinensis Bunge Fruit with an Orthogonal Test and Its Antioxidant

CHEN Yuan
School of Information Engineering/Zhengzhou University, Zhengzhou 450001，China

Abstract:To optimize the extraction of total flavonoids in Cercis chinensis Bunge and study on the scavenging effect on hydroxyl radicals，the preferred extraction conditions were determined by a single factor and orthogonal test. The results showed that the extraction ratio of flavonoids reached up to 2.910%at ethanol concentration of 75%，solid-liquid ratio of 1.5:60 mg/mL，temperature 85℃and extraction time 2.5 h. Antioxidant effect of flavonoids was higher than BHT and it was increasing with the concentration.

Keywords:Cercis chinensis Bunge fruit；flavonoids；extraction ratio；antioxidant

作者简介：陈园（1964-），女，硕士，讲师，研究方向:计算机应用. E-mail:hbzyjsxy@163.com

收稿日期：2013-11-19修回日期：2014-01-13

中图法分类号:S131；S132

文献标识码:A

文章编号:1000-2324（2016）01-0043-04