昆虫肠道微生物多样性研究进展

鲁迎新，刘彦群，李 群，夏润玺，王 欢，2*

(1.沈阳农业大学 生物科学技术学院,辽宁 沈阳110161； 2.沈阳工学院,辽宁 抚顺 113122)



昆虫肠道微生物多样性研究进展

鲁迎新1，刘彦群1，李 群1，夏润玺1，王 欢1，2*

(1.沈阳农业大学 生物科学技术学院,辽宁 沈阳110161； 2.沈阳工学院,辽宁 抚顺 113122)

昆虫肠道内存在种类繁多、数量庞大的微生物，这些肠道微生物种群结构的多样性与昆虫种类、龄期、消化道形态、食物的喂养条件、生存环境等息息相关。近几年，随着大规模测序技术、组学技术的发展，应用分子生物学技术快速、定性、定量研究昆虫肠道微生物种群的多样性已成为热点。介绍了昆虫肠道微生物的分类和检测方法，综述了昆虫肠道微生物多样性的研究进展，以期为昆虫与其肠道微生物的协同进化和害虫防治等研究提供基本方法和数据，为今后昆虫肠道微生物的研究提供理论参考。

昆虫； 肠道微生物； 多样性； 检测方法

昆虫是全球最多样化、数量最多、进化历史最悠久、分布最广泛的动物之一[1]，而这些特征与昆虫的共生物以及生存环境密不可分。昆虫的共生物，尤其是肠道微生物能够提高贫瘠食物的营养、帮助消化食物，提高对天敌、寄生虫和病原菌的防护，影响昆虫种间、种内物质交流,传播疾病，甚至具有调控交配和生殖系统的功能[2-3]。昆虫的肠道伴随取食、消化、排泄等活动,是一个可变的动态环境[4]，肠道微生物的结构、数量和种类也富于动态变化，这些变化都会对昆虫产生一定的影响，因此已经有很多学者从微生态学角度研究昆虫与肠道微生物的共生关系[5-6]。近几年随着大规模测序技术、组学技术的发展，生命科学也步入了“大数据”时代，应用分子生物学技术快速、定性、定量研究昆虫肠道微生物种群的多样性已经成为热点。综述了昆虫肠道微生物多样性的研究进展，以期为昆虫与其肠道微生物的协同进化和害虫防治等研究提供基本方法和数据，为今后昆虫肠道微生物的研究提供理论参考。

1 昆虫肠道微生物的种类

昆虫肠道微生物可根据其在肠道内生存定居的时间及其与昆虫的关系进行分类[7-8]。在肠道占有特定区域的微生物是常驻微生物群落(autochthonous或indigenous)；而不能在健康昆虫肠道内长期生存的微生物为过路微生物群落(allochthonous或transient)。有些过路微生物对昆虫具有致病作用，如苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis)、嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdusnematophila)、发光杆菌 (Photorhabdusluminescens)等是病原菌(pathogen)；而能够保护寄主、抵御疾病的微生物是益生菌(probiotics)[9]。有些肠道微生物能够与昆虫互利共生则为共生菌[10-11]，包括兼性共生菌和专性共生菌，兼性共生菌通常可以体外培养[12-13]，离开昆虫对昆虫没有影响或影响很小；但昆虫在缺少专性共生菌的情况下两者均无法存活[14]。有些肠道微生物会对昆虫的生长发育造成明显影响，甚至可能导致寄主死亡，这类微生物为寄生菌。

2 昆虫肠道微生物多样性检测方法

2.1 传统培养检测方法

传统培养检测方法是在分离培养昆虫肠道微生物的基础上，根据菌株形态和生理生化特征进行鉴定检测[15]。这种方法需要体外培养昆虫肠道微生物，目前可用于检测昆虫肠道微生物的培养基包括牛肉膏蛋白胨(NA)培养基、LB培养基、克氏双糖铁琼脂(KIA)培养基、三糖铁琼脂(TSI)培养基、赖氨酸铁琼脂(LIA)培养基、不发酵革兰阴性杆菌初筛鉴定培养基、柠檬酸盐甘露醇琼脂培养基、气单胞菌初筛鉴定培养基等。由于培养方法、培养基成分和技术的限制，很多昆虫肠道微生物无法体外培养[16-17]，因此传统培养检测鉴定方法得到的信息十分有限。

2.2 基于16S rRNA基因的分子检测方法

16S rRNA是原核细胞核糖体30S小亚基的组成部分，其编码基因存在于所有细菌的基因组中。16S rRNA基因具有高度的保守性和特异性，基因片段长度比较适宜，碱基排列顺序复杂度适中，可用通用PCR引物或探针对特定微生物进行种类鉴定，由于其具有9个可变区，也可设计一些特异性的引物和探针，进行某些特定细菌属、种的鉴定[18-19]。

16S rRNA基因序列法基于不同微生物种类核酸组成上的差异，通过采用某些引物扩增差异基因或直接对核酸进行测序，将所获得的核酸序列与一些基因数据库中的已知序列进行比对，进而分析不同微生物之间的相互关系。由于16S rRNA基因检测技术序列测定和分析比对操作相对简单，已成为昆虫肠道微生物检测和鉴定的一种强有力工具[20]。

2.3 基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序检测方法

焦磷酸测序法是依靠生物发光对DNA序列进行检测的方法[21-22]。超高通量基因组测序系统GS-FLX能够在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号释放偶联起来，通过检测荧光信号释放的有无和强度，可实时测定DNA序列。此技术不需要荧光标记的引物或核酸探针，也不需要进行电泳，具有分析快速、准确、高灵敏度和高自动化的特点[23-25]。

利用基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统能够得到大量的表达序列标签(EST)，通过对这些EST序列与已知数据库进行生物信息学分析比较，能够全面了解和分析昆虫肠道微生物的多样性。

2.4 基于宏基因组学的检测方法

宏基因组学(metagenomics)也称为元基因组学，是以样品中的微生物群落作为整体进行研究的学科[26-27]。宏基因组学研究不要求对每个微生物进行分离纯化培养，而是直接从环境样品中提取全部微生物，或通过测序探究环境中微生物的群落结构和功能(序列驱动)，或构建宏基因组文库，从而筛选新的基因或生物活性物质(功能驱动)。这种方法克服了传统培养方法的缺陷，极大地丰富了人们对微生物多样性及其功能的认知[28]。

高通量测序技术和基因芯片技术是宏基因组技术中的2类关键技术。测序技术可以发现新物种和新基因，但由于测序深度有限、定量性差，不易发现低丰度物种且易受污染物干扰；芯片技术很好地克服了这些局限，但不易于发现新基因，将2类技术结合起来的综合研究越来越多[29]。通过采用宏基因组技术，能够解释微生物群落多样性、种群结构、进化关系、功能活性及其与环境之间的相互协作关系，极大地扩展了微生物学研究范围，也为昆虫肠道微生物多样性研究提供了新方法。

2.5 基于DGGE指纹图谱技术的检测方法

DGGE(变性梯度凝胶电泳)指纹图谱技术是根据DNA在不同浓度的变性剂中解链行为不同而导致电泳迁移率发生变化，从而将片段大小相同而碱基组成不同的DNA片段分开的一种技术。这种技术能将同样大小的DNA片段很好地分开，是一种有效的分子标记方法。

DGGE指纹图谱技术具有突变检出率高、操作简便、快速、重复性好等优点，还能够提供群落中优势种类信息并同时分析多个样品，适合于调查种群的时空变化,并且可通过对条带的序列分析或与特异性探针杂交分析鉴定群落组成，现已广泛应用于生物多样性调查等多个领域[30-33]。

3 昆虫肠道微生物多样性研究概况

3.1 家蚕肠道微生物的多样性

家蚕(Bombyxmori)是重要的经济昆虫和模式昆虫，其肠道中的微生物种类、数量不仅影响蚕体对营养物质的吸收与转化，而且影响蚕体的健康[34-35]。袁志辉等[34]采用非培养法和传统培养法相结合的方法，对家蚕5龄幼虫肠道微生物进行了调查和分析，发现家蚕的肠道细菌在分类上主要属于节杆菌属(Arthrobacter)、乳杆菌属(Lactobacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、微球菌属(Micrococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)和葡萄球菌属(Staphylococcus)，它们在家蚕生长发育中起着重要的作用，尤其是在消化利用桑叶和疾病的预防中凸显优势。田贞华等[36]采用普通培养基和稀释培养基从家蚕4龄第3天幼虫的中肠内容物分离出109株细菌，属于芽孢杆菌属、节杆菌属、肠杆菌属(Enterobacter)、微杆菌属(Microbacterium)、葡萄球菌属、短杆菌属(Brevibacterium)、纤维微杆菌属(Cellulosimicrobium)、肠球菌属(Enterococcus)、短状杆菌属(Brachybacterium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)，揭示了家蚕肠道细菌种群的多样性；而2种培养基相比，稀释培养基能分离出更多的微生物[37-38]。

蚕的性别、龄期和不同饲料喂养都会对蚕的肠道微生物种类造成影响。相辉等[39]采用DGGE和16S rDNA文库序列分析的方法，研究发现不同发育阶段幼虫的肠道细菌组成存在差异，家蚕肠道特殊菌群的出现可能与食性有关系，饲料改变会引起肠道微生态平衡发生变化。向芸庆等[40]以不同的桑科植物(柘叶与桑叶)分别饲养家蚕洞庭×碧波杂交种,采用纯培养分离检测技术和16S rDNA序列测定及系统发育分析方法，对家蚕4、5龄幼虫肠道优势菌群的类型进行了鉴定和差异性分析，发现柘叶与桑叶饲养的家蚕中肠均具有以下4个优势菌群：短波单胞杆菌属(Brevundimonas)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、肠杆菌属和葡萄球菌属；饲料的改变导致家蚕肠道微生态细菌种群组成发生变化，利用桑叶饲养的家蚕幼虫肠道中分离出5个特有的优势菌群[气单胞菌属(Aeromonas)、短杆菌属、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、埃希氏菌属和克雷伯氏菌属(Klebsiella)]，而利用柘叶饲养的家蚕幼虫肠道中仅分离出假单胞菌属和土壤杆菌属(Agrobacterium)2个特有优势菌群，这种改变可能与柘叶饲养家蚕生长发育不良、容易患病具有相关性，说明鳞翅目昆虫的生长发育及抗病性与肠道微生物的多样性相关。许刚等[41]利用基于焦磷酸测序技术检测细菌16S rRNA基因序列的方法分析了家蚕5龄第3天雌、雄幼虫中肠内微生物的多样性，发现雌蚕与雄蚕肠道微生物类群的组成和所占比率存在明显差异，而代尔夫特菌属(Delftia)、橙单胞菌属(Aurantimonas)、假单胞菌属、嗜糖假单胞菌属(Pelomonas)、肠球菌属、台湾温单胞菌属(Tepidimonas)、阿斯普罗单胞菌属(Aspromonas)和甲基杆菌属(Methylobacterium)为主要优势菌属。不同家蚕品种之间的肠道微生物类群组成存在明显差异，这可能是影响家蚕抗性的原因之一[2,41]。以上研究为家蚕的饲育及其肠道微生物的功能研究提供了基础数据。

3.2 小菜蛾肠道微生物的多样性

小菜蛾(Plutellaxylostella)不仅是危害十字花科蔬菜最为严重的害虫之一，也是抗性发展最快和抗药性最严重的害虫之一，目前对其抗性和生物防治的研究备受关注[42]。小菜蛾中肠栖息着大量的微生物，这些微生物与小菜蛾的生长发育、免疫、抗性息息相关，深入研究这些肠道微生物可为小菜蛾的综合防治和抗性治理提供理论基础和技术手段。

夏晓峰[43]通过对小菜蛾敏感品系幼虫中肠微生物16S rRNA 基因V6高变区进行测序分析发现，小菜蛾中肠微生物由变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、蓝细菌门(Cyanobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、广古菌门(Euryarchaeota)、担子菌门(Basidiomycota)和子囊菌门(Ascomycota)组成，其中变形菌门和厚壁菌门是丰度最高的2个细菌门类，变形菌门中含量最高的是肠杆菌目(Enterobacteriales)和乳杆菌目(Lactobacillales)细菌，肠杆菌目中丰度最高的是阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)和阿氏肠杆菌(E.asburiae)，乳杆菌目中含量最高的是肉杆菌(Carnobacteriummaltaromaticum)，这3种菌的高丰度表明它们对宿主可能具有重要的功能。小菜蛾幼虫专性取食十字花科植物，而成虫主要取食蜂蜜，基于宏基因组测序技术发现，小菜蛾成虫期中肠内阿氏肠杆菌的丰度有较大的升高，而阴沟肠杆菌的丰度下降，推测该改变可能与小菜蛾食性的转变相关[43-44]。

小菜蛾中肠细菌的组成和结构能够影响其对农药的抗性，夏晓峰[43]利用分离纯化的厚壁菌门细菌肠球菌(Enterococussp)、变形菌门细菌肠杆菌(Enterobactersp)和沙门菌(Serratiasp)分别饲喂小菜蛾，发现肠球菌显著提高了小菜蛾对毒死蜱的抗性，沙门菌显著降低了小菜蛾对毒死蜱的抗性，肠杆菌对小菜蛾毒死蜱抗性的影响不显著。进一步研究发现，中肠细菌直接参与农药的代谢降解并不是其介导农药抗性的主要机制，厚壁菌门的肠球菌和抗生素对小菜蛾中肠解毒酶基因的调控相似，均能够诱导小菜蛾中肠谷胱甘肽-硫-转移酶(GST)和羧酸酯酶(COE)基因高表达，提高小菜蛾对农药的抗性。近年来，一些研究者提出昆虫肠道微生物可以减少病原菌的增殖或降低病原菌引起的寄主死亡率。戴南晶[45]发现，昆虫肠道微生物的存在对苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis，简称Bt)引起的死亡具有一定的影响。普城沙雷菌和泛菌属细菌在Bt发挥其杀虫活性的过程中对小菜蛾起到了一定的保护作用，随着菌浓度的增大，Bt对小菜蛾幼虫的致死率逐渐下降。这些研究为小菜蛾的综合防治和抗性治理提供了新对策和新途径。

3.3 棉铃虫肠道微生物的多样性

棉铃虫(Helicoverpaarmigera)是棉花蕾铃期的重大害虫，广泛分布在中国及世界各地。杨焊[46]采用传统微生物培养方法与16S rRNA基因序列分析相结合，从棉铃虫老熟幼虫肠道中分离并鉴定出21个细菌种类，属于6个纲[α-变形菌纲(α-Proteobacteria)、β-变形菌纲(β-Proteobacteria)、γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria)、放线菌纲(Actinobacteria)、鞘脂杆菌纲(Sphingobacteria)、芽孢杆菌纲(Bacilli)]，12个属[芽孢杆菌属、肠杆菌属、肠球菌属、克雷伯氏菌属、马赛菌属(Massilia)、微杆菌属、微球菌属、假单胞菌属、红球菌属(Rhodococcus)、鞘脂杆菌属(Sphingobacterium)、假平胞菌属(Sphingomonas)、葡萄球菌属][47]。

Bt是目前应用最广泛的微生物杀虫资源，但害虫抗性的产生向Bt制剂和抗虫转基因作物的高效、可持续利用提出了巨大挑战。姜玮瑜等[48]通过比较Cry1Ac蛋白抗性及敏感棉铃虫中肠细菌群落的结构组成，研究了中肠微生物与棉铃虫Bt抗性产生的相关性。16S rDNA文库测序结果表明，抗性品系与敏感品系棉铃虫中肠细菌群落特别是优势菌群非常相似，但在部分劣势菌群上存在差异；DGGE图谱分析表明，这2个品系棉铃虫中肠菌群相似性达到92.3%。说明敏感品系与抗性品系棉铃虫肠道菌群组成极其相似，推测抗性的产生与肠道微生物无直接关系。这一结果与小菜蛾的相关研究结果有所不同，推测不同昆虫的肠道微生物与抗性的相关性不同。

3.4 黄翅大白蚁肠道微生物的多样性

白蚁属于等翅目昆虫,是木质纤维素的高效降解者之一,能够降解所摄取植物材料中的纤维素类物质,在全球碳循环中发挥了至关重要的作用。近年来,白蚁高效的木质纤维素降解能力吸引了研究者们的极大关注，而这种能力与其肠道微生物密切相关，其前肠和中肠都相对较小，后肠中有较为膨大的囊形区域，存在较多的共生微生物[49-53]，优势菌主要为变形菌门、螺旋体门(Spirochaetes)、厚壁菌门的梭菌目(Clostridiales)以及拟杆菌门(Bacteroides)细菌[54]。员超等[55]采用活性电泳和DGGE指纹图谱技术对黄翅大白蚁(Macrotermesbarneyi)后肠微生物群落进行分析，检测到黄翅大白蚁肠道环境中含有白地霉属(Galactomyces)、粪壳菌属(Sordariomycetidae)真菌，芽孢杆菌属、微杆菌属、变形杆菌属(Proteobacterium) 和无色杆菌属(Achromobacter)细菌，其中芽孢杆菌属细菌具有纤维素降解所需的内切葡聚糖酶，此外，白蚁肠道共生细菌中含有很多没有被利用的纤维素水解酶基因[56]。这些结果为人们进一步了解高等白蚁的木质纤维素降解机制以及白蚁-肠道微生物共生体系提供了基本数据。

3.5 暗黑鳃金龟肠道微生物的多样性

暗黑鳃金龟(Holotrichiaparallela) 是我国重要的杂食性地下害虫，主要危害花生、大豆及薯类作物的幼果和嫩根，对农作物的产量影响很大[57-58]。朱琳等[59]利用传统分离方法，从人工饲养的暗黑鳃金龟幼虫肠道中分离纯化出10个细菌菌株，分别属于鲁氏耶尔森菌(Yersiniaruckeri)、侧孢芽孢杆菌(B.laterosporus)、坚强芽孢杆菌(B.firmus)、放线杆菌属(Actinobacillus)、飞虫杀雄菌(Arsenophonusnasoniae)、不动杆菌属(Acinetobacter)、气单胞菌、沙门菌属(Salmonella)、短芽孢杆菌(B.brevis)、变形菌属(Proteus)；进一步研究发现，这些肠道细菌在培养状态、生理性状和生化特性等方面存在较多差异。该研究从微生态学角度研究探讨了暗黑鳃金龟幼虫的营养生理活动及其肠道菌群的构成，为其资源开发及生物防治提供理论依据。

暗黑鳃金龟幼虫主要以植物根、茎等高纤维素含量的食物为食,其后肠发酵腔中富含丰富多样的微生物,可能在宿主纤维性食物的消化、降解过程中发挥着重要的作用[60]。黄胜威[61]利用16S rRNA基因序列分析和PCR-DGGE分析技术对暗黑鳃金龟幼虫不同龄期中、后肠微生物多样性进行分析发现，暗黑鳃金龟幼虫中肠肠道细菌主要归入7个细菌纲，分别是δ-变形菌纲(δ-Proteobacteria)、放线菌纲、β-变形菌纲、α-变形菌纲、γ-变形菌纲、梭菌纲(Clostridia)和拟杆菌纲(Bacteroidetes)；而不同龄期幼虫肠道微生物类群的组成和所占比率存在明显差异，1龄幼虫肠道中只有δ-变形菌纲、β-变形菌纲、γ-变形菌纲、梭菌纲和拟杆菌纲，2龄时多了放线菌纲，3龄时增加了α-变形菌纲；后肠肠道细菌分别属于δ-变形菌纲、β-变形菌纲、α-变形菌纲、γ-变形菌纲、梭菌纲、拟杆菌纲、放线菌纲和芽孢杆菌纲。此研究为探讨暗黑鳃金龟幼虫肠道微生物的生理功能奠定了基础。

除上述昆虫外，很多昆虫(如菜青虫[47]、稻纵卷叶螟[47]、桑粒肩天牛幼虫[62]等)的肠道微生物也已经通过不同的方法进行了研究和分析，这些研究为有害生物综合治理提供了基本数据和理论基础。

4 展望

昆虫通常从环境、食物中获得各类微生物，经过长期历史进化，有些微生物群落经过肠道环境选择后与昆虫共生，这些肠道微生物通过参与昆虫营养、消化和防御影响其发育。当昆虫处在不利于进食的环境中时，肠道内的酶可消化吸收昆虫肠道微生物中的营养成分，有利于昆虫的生长发育。植食性昆虫肠道内含有可降解纤维素的共生菌，能够维持昆虫的自身稳定。当病原菌入侵昆虫时，引起系统感染，昆虫肠道中有益微生物对病原菌亦能产生拮抗作用，从而保护昆虫。

随着社会的发展，环境保护和生态稳定日益引发人们的强烈关注，新的害虫生物防治方法和理论层出不穷，通过研究昆虫肠道菌群和肠道微生态探索新的害虫防治方法得到了国内外的广泛关注。根据肠道微生物的研究结果可以科学环保地进行害虫防治，如可以试图导入加有杀虫基因的微生物至昆虫肠道，从而达到杀虫的目的，此方法在白蚁等害虫的生物防治领域已取得了初步研究进展，相信在以后的实践研究中会开辟更多更广泛的新思路。

昆虫肠道内存在大量的微生物，这些微生物通常由细菌、螺旋体、真菌和原生动物组成[63]。不同昆虫的肠道微生物的种属数量、类别以及每种微生物的含量存在很大的差异，相同昆虫的不同龄期、不同生存环境、不同食物的喂养、不同身体状况对其肠道微生物能够产生不同程度的影响。相信随着更广泛、更全面研究的开展，人们能够发现肠道微生物的更多功能，打破目前鉴定手段和检测方法的相对局限，发现更全面的菌群种类。

目前人们已经对许多昆虫的肠道微生物种类进行了研究，但对很多肠道微生物的作用和功能并不太了解，对于肠道微生物量的变化情况亦不清楚，在微生态学和分子生态学上探讨肠道微生物多样性的研究还很狭隘，更多的研究将会为微生态学和分子生态学理论提供新的内容，为害虫可持续控制和抗性治理提供新途径。

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Research Progress on Intestinal Microbial Diversity of Insects

LU Yingxin1,LIU Yanqun1,LI Qun1,XIA Runxi1,WANG Huan1，2*

(1.College of Bioscience and Biotechnology,Shenyang Agricultural University,Shenyang 110161,China；2.Shenyang Institute of Technology，Fushun 113122,China)

There are a wide variety and large number of microbes in insect gut.The population diversity of intestinal microbes is related to insect species,age，intestinal morphology,food,feeding conditions and living environment,etc.In recent years,rapid,qualitative and quantitative study of intestinal microbial diversity by molecular biology techniques has become a hot spot with the development of the large-scale sequencing and omics technologies.In this paper,the classification and detection method of the insect intestinal microbes were described,and the progress on intestinal microbial diversity of insects was reviewed.Those would provide basic data and methods for research of insect gut microbes and pest control.

insect; intestinal microbes; diversity; detection method

2016-06-11

国家自然科学基金项目(30800803)；辽宁省大学生创新训练项目(201413201014)

鲁迎新(1992-)，女，辽宁朝阳人，在读硕士研究生，研究方向：动物细胞与分子生物学。 E-mail:luyingxin329@163.com

*通讯作者：王 欢(1977-)，女，辽宁沈阳人，副教授，博士，主要从事昆虫病理与生物防治研究。 E-mail:zanhuan@163.com

Q938

A

1004-3268(2016)11-0001-07