肺结核治疗过程中血清IL-10、IL-12p40、IL-12p70、IL-17A、IL-4、IL-6和IP10水平动态观察

劳穗华 谢 贝 董海平 张言斌 孟繁荣 俞朝贤 陈 华 邓晓华 王 楠杨 瑜 雷 杰 牛 群 刘志辉

肺结核治疗过程中血清IL-10、IL-12p40、IL-12p70、IL-17A、IL-4、IL-6和IP10水平动态观察

劳穗华 谢 贝 董海平 张言斌 孟繁荣 俞朝贤 陈 华 邓晓华 王 楠杨 瑜 雷 杰 牛 群 刘志辉

目的分析肺结核患者治疗过程中血清IL-10、IL-12p40、IL-12p70、IL-17A、IL-4、IL-6和IP10水平的动态变化，以进一步阐明这些因子与结核病发生发展的关联性。方法应用液相芯片技术检测59例成功治愈的初治菌阳肺结核患者治疗前、治疗2个月末和6个月末的血清IL-10、IL-12p40、IL-12p70、IL-17A、IL-4、IL-6和IP10水平，应用配对t检验分别比较各因子3个时点间的血清表达水平差异。结果3个时间点血清IL-10、IL-12p40、IL-12p70、IL-17A、IL-4、IL-6和IP10水平(pg/mL):治疗前分别为1.71±0.91、5.02±11.53、2.48±11.03、1.12±0.46、0.36±1.87、8.99±7.82和882.74±1110.73，治疗2个月末分别为2.39±1.47、8.95±13.76、1.77±1.80、0.96±0.22、0.51±1.11、4.75±4.16和408.38±492.27，治疗6个月末分别为1.84±0.93、5.14±10.16、1.59±0.78、0.79±0.22、0.44±0.48、4.05±4.51和177.57±104.83。治疗前与治疗2个月末及治疗6个月末的IL-6水平、治疗前与治疗2月末的IL-10和IL-12p40水平以及治疗前、治疗2个月末、6个月末的IL-17A和IP10水平均有显著性差异(P＜0.05)。结论血清IL-17A、IP10、IL-6、IL-10和IL-12p40水平与结核病的发生发展存在密切关联。

结核/肺;细胞因子;液相芯片

【Author's address】 Guangzhou Chest Hospital，Guangzhou，510095，China

对于结核病的发生发展，目前人们已经了解到人体感染结核分枝杆菌后是否进展为结核病，取决于病原菌与宿主防御间的力量对决，其中以细胞免疫为主体的宿主防御能力的大小决定结核病发生发展方向［1］。其中，各种细胞因子作为各种免疫细胞的激活与强化其功能的重要介质而在结核病发生发展中发挥重要作用［2］。但细胞因子的功能呈现多效性、重叠性、协同性、拮抗性、网络性等特点［3］，各种细胞因子在结核病发生发展中的作用远未明晰。为此，我们对目前认为与结核密切相关的IL-10、IL-12p40、IL-12p70、IL-17A、IL-4、IL-6和IP10等细胞因子［4］在结核病治疗过程中的动态水平进行了观察，现报告如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

在我院结核病生物样本库中选取2013年1月-2013年12月在抗结核治疗前、治疗2个月末和治疗6个月末有血样采集的59例成功治愈的初治菌阳(抗酸杆菌涂片或分枝杆菌培养阳性并鉴定为结核分枝杆菌者)肺结核病患者，其中:男34例，年龄17～75岁，平均42.0岁。女25例，年龄17～78岁，平均41.0岁。

1.2 仪器和试剂

应用多功能液相芯片系统luminex200(luminex公司)、采用MILLIPLEX MAP试剂盒(EMD Millipore公司)进行IL-10、IL-12p40、IL-12p70、IL-17A、IL-4、IL-6和IP10等细胞因子检测。

1.3 血清样本采集

在患者抗结核治疗前、治疗2个月末和治疗6个月末采集患者静脉血，常规分离血清，-80℃冻存备用。

1.4 细胞因子检测

从结核病生物样本库中取出待检样本，室温冻融;严格按照仪器和试剂说明书操作，检测目的细胞因子。主要实验步骤包括:①每孔加入200μL洗脱液，室温震摇10min，弃掉洗脱液;②各孔分别加25μL标准品或样本(空白孔加入生理盐水)、25μL试验液、25μL基质液和25μL磁珠;③以上混合液室温震摇孵育2 h;④ 使用磁力平板洗涤器洗涤平板2次后，每孔加入25μL1×检测抗体，室温震摇孵育1 h;⑤每孔加入25μL链霉亲和素-藻红蛋白，室温震摇孵育30min;⑥加200μL洗脱液洗板2次，每孔加入150μL鞘液重悬磁珠，室温震摇5min;⑦Luminex200TM系统检测。

1.5 统计学处理

应用SPSS18统计分析患者抗结核治疗前、治疗2个月末和治疗6个月末 IL-10、IL-12p40、IL-12p70、IL-17A、IL-4、IL-6和IP10等细胞因子的血清水平±s/(pg·mL-1)，并行配对t检验分别比较各因子三个时点间的血清表达水平差异。

2 结果

血清IL-10、IL-12p40、IL-12p70、IL-17A、IL-4、IL-6和IP10水平见表1。

经正态性检验，这些细胞因子水平均服从正态分布，经方差齐性检验所分析的配对样本总体方差齐性。行配对t检验，治疗前与治疗2个月末及治疗6个月末的IL-6水平、治疗前与治疗2个月末的IL-10和IL-12p40水平以及治疗前、治疗2个月末、6个月末的IL-17A和IP10水平有显著性差异(P＜0.05)。

表1 59例成功治愈菌阳肺结核患者治疗前、2月末和6月末各细胞因子水平及其比较 (±s，pg/mL)

表1 59例成功治愈菌阳肺结核患者治疗前、2月末和6月末各细胞因子水平及其比较 (±s，pg/mL)

注:1)前/中、中/后和前/后分别指治疗前与治疗2个月末、治疗2个月末与治疗6个月末、治疗前与治疗6个月末比较

细胞因子 IL-10 IL-12 p40 IL-12 p70 IL-17A IL-4 IL-6 IP-10细胞因子水平 治疗前 1.71±0.91 5.02±11.53 2.48±11.03 1.12±0.46 0.36±1.87 8.99±7.82882.74±1110.732月末 2.39±1.47 8.95±13.76 1.77±1.80 0.96±0.22 0.51±1.11 4.75±4.16 408.38±492.276月末 1.84±0.93 5.14±10.16 1.59±0.78 0.79±0.22 0.44±0.48 4.05±4.51 177.57±104.83配对t检验1)t前/中P前/中-3.5490.001-2.1070.0390.5260.6012.6660.010-0.5310.5974.3020.0003.2720.002 t中/后P中/后2.9950.0042.8640.0060.8740.3865.8550.0000.4550.6510.9420.3503.9890.000 t前/后4.9320.000 P前/后-0.8720.387-0.0900.9290.6280.5325.5290.000-0.3600.7204.6080.000

3 讨论

血清IL-10、IL-12p40、IL-12p70、IL-17A、IL-4、IL-6和IP10等细胞因子主要由淋巴细胞或单核/巨噬细胞产生，其功能作用主要为:IL-10抑制活化的巨噬细胞和树突状细胞产生IL-12而负调节IFN-γ的分泌，IL-12刺激NK细胞和T细胞产生IFN-γ并促进Th0细胞分化为Th1细胞，IL-17是参与固有免疫和加强适应性免疫的重要因子，IL-4促进Th2细胞分化，IL-6促进B淋巴细胞功能并参与诱导Th0细胞向Th17细胞分化，IP-10则为一种IFN-γ诱导蛋白而促进其分泌［5］。来自南非的一项研究［6］显示包括上述细胞因子在内的30个细胞因子在抗结核治疗过程中的动态变化可以指示机体对抗结核治疗反应性快慢。我们的分析结果也表明治疗前与治疗2个月末及治疗6个月末的IL-6水平、治疗前与治疗2个月末的IL-10和IL-12p40水平以及治疗前、治疗2个月末、6个月末的IL-17A和 IP10水平有显著性差异(P＜0.05)。我们可以设想:结核病发生发展可以视为结核病治愈的逆过程，这些细胞因子参与了结核病发生发展过程。

从表1可以看到:血清IL-10水平治疗前显著低于治疗2个月末，而治疗6个月末又恢复到治疗前水平;治疗前血清IL-12 p40水平显著低于治疗2个月末、治疗2个月末显著高于6个月末;血清IP-10水平则随有效治疗的进行而不断降低。直观来看似与上述这些细胞因子的主要功能作用有些相互矛盾:治疗前IL-10水平的低下应有较高水平的IL-12 p40，治疗6个月末的低水平IL-10应使6个月末的IP-10水平上调。但从细胞因子功能的多效性、重叠性、协同性、拮抗性、网络性等特点［3］的角度理解，更加提醒人们细胞因子在抗结核免疫过程中的复杂性，有待深入研究。

从这些细胞因子在抗结核治疗过程中的动态变化来看，在网络复杂性的背后，我们应注意到:治疗过程中患者血清IL-17A和IP-10表达水平不断下降的变化趋势。IL-17A作为连接固有免疫和适应性免疫的效应分子、IP-10作为IFN-γ诱导蛋白在抗结核过程中作用非同寻常。那么，我们是否可以认为:这些细胞因子的复杂作用结果最后可以聚焦于IL-17A、IP-10水平的变化，因为IL-10、IL-12p40、IL-12p70、IL-4、IL-6等的作用均与IFN-γ分泌密切相关;正如IFN-γ水平可以指示结核分枝杆菌感染一样，血清IL-17A、IP-10水平联结着结核病活动性水平。IL-17AIP-10作为Th17细胞的主要分泌因子、IP-10作为IFN-γ诱导蛋白是否可以真正联结结核病活动性水平呢?本文分析结果难以深刻阐明，假若在治疗失败结核病例中观察不到IL-17A、IP-10的此种动态变化，这一联结即应成立。作为本研究的继续，我们在后续的6例治疗失败结核病例研究中未能观察到此种动态变化。但其内在本质如何，尚待大样本量的研究而得出科学结论。与此同时，从表1还可看到在不同时点不同细胞因子水平的分析中有11个水平的标准差大于其平均值，进一步分析发现在这些分析项实验数据中均有3～4个离群值数据，按Chanwennt准则其出现概率超过1/2n(n为样本量)不宜舍弃。说明这些因子在血清的表达水平离散程度较大，也从另一侧面反映了细胞因子在抗结核免疫过程中的复杂性。据此，这些因子能否作为结结核病活动性水平的观察指标有待扩大样本量分析以进一步证实。

另外，本文的分析数据还展现了一个可能的实际应用前景，即通过结核病患者治疗过程中血清IL-17A、IP-10水平的监测指示抗结核治疗效果。目前，对于抗结核治疗疗效最常用的评价指标是治疗2个月末与6个月末的痰菌阴转率、影像学检查结果改变及临床症状的改善情况。其缺陷显而易见，最直接的后果是:一旦化疗疗效不理想，即实际上我们对患者至少进行了2个月的不合理化疗，从而导致疾病慢性化、耐药性产生的风险大大增加。若能通过更短时间的血清IL-17A、IP-10水平监测指示抗结核治疗的效果，其临床应用价值不言而喻，值得关注，我们正在进行这一工作。

［1］ERNST J D.The immunological life cycle of tuberculosis［J］.Nat Rev Immunol，2012，12(8):581-591.

［2］ZUÑIGA J，TORRES-GARCíA D，SANTOS-MENDOZA T，et al.Cellular and humoral mechanisms involved in the control of tuberculosis［J/OL］.Clin Dev Immunol，2012:193923.doi:10.1155/2012/193923.

［3］曹雪涛.医学免疫学［M］.北京:人民卫生出版社，2013:49-57.

［4］JOHN S H，KENNETH J，GANDHE A S.Host biomarkers of clinical relevance in tuberculosis:review of gene and protein expression studies［J］.Biomarkers，2012，17(1):1-8.

［5］龚非力.医学免疫学［M］.北京:科学出版社，2014:37-57.

［6］DJOBA SIAWAYA J F，BEYERS N，VAN HELDEN P，et al.Differential cytokine secretion and early treatment response in patients with pulmonary tuberculosis［J］.Clin Exp Immunol，2009，156(1):69-77.

多囊肾潜在治疗靶点:HDAC6

常染色体显性多囊肾(ADPKD)是一种遗传性疾病，发病率为1∶1000～1∶500，临床特点为肾小管内囊肿形成，囊内充满液体。囊肿进展性增大，并取代肾实质，近50%的ADPKD患者在50岁左右可进展为终末期肾病。ADPKD是一种由PKD1或PKD2基因突变引起的异质性疾病。PKD1或PKD2基因突变可导致多个与囊肿生长相关的信号通路失调。动物模型结果显示，靶向作用于特殊通路可延缓囊肿生长，但目前为止ADPKD尚不可治愈。

摘自《医学论坛网》

Dynamic Survey of IL-10，IL-12p40，IL-12p70，IL-17A，IL-4，IL-6 and IP10 in Serum during Treatment of Patients with Pulmonary Tuberculosis

LAO Suihua，XIE Bei，DONG Haiping，et al

ObjectiveTo further understand the correlation between progression of tuberculosis with these cytokines by dynamic analysis of levels of IL-10，IL-12p40，IL-12p70，IL-17A，IL-4，IL-6 and IP10 in serum during treatment of patients with pulmonary tuberculosis.MethodsIL-10，IL-12p40，IL-12p70，IL-17A，IL-4，IL-6 and IP10 in serum of59 patients with pulmonary tuberculosis and treated successfully at three point of time，including before treatment and the end of second and sixth month during period of treatment，were detected with liquid chip technology.The general levels of these cytokines at per point of time were compared respectively by paired t-test.ResultsThe general levels(pg/ml)of IL-10，IL-12p40，IL-12p70，IL-17A，IL-4，IL-6 and IP10 in serum were2.39±1.47，8.95±13.76，1.77±1.80，0.96±0.22，0.51±1.11，4.75±4.16，408.38±492.27 at the end of second month and1.84±0.93，5.14±10.16，1.59±0.78，0.79±0.22，0.44±0.48，4.05±4.51，177.57±104.83 at the end of sixth month during period of treatment while they were1.71±0.91，5.02±11.53，2.48±11.03，1.12±0.46，0.36±1.87，8.99±7.82 and882.74±1110.73 before treatment respectively.There were significantly differences between the levels of IL-6 at the end of second month and that before treatment and between that at sixth month and that before treatment.There were also significantly differences between the levels of IL-10 and IL-12p40 at the end of second month and that before treatment.As to IL-17A and IP10，there were significantly differences between each other of their levels at three point of time.ConclusionIt seems probable that there are strong correlations between progression of tuberculosis and levels of IL-17A，IP10，IL-6，IL-10 and IL-12p40 in serum.

Tuberculosis/Pulmonary;Cytokine;Liquid Chip Technology

R521;R446.6

:Adoi:10.3969/j.issn.1671-332X.2016.08.028

广东省科技计划项目(编号:粤科规财字［2015］110号32);广东省医学科学技术研究基金(编号:A2016383);广州市科技计划项目(编号:2014Y2-00117，155700012)

劳穗华 谢 贝 董海平 张言斌 孟繁荣 俞朝贤 陈 华

邓晓华 王 楠 杨 瑜 雷 杰 牛 群 刘志辉:广州市胸科医院 广东广州 510095

刘志辉