茶叶中大肠菌群检测方法的研究

武疆（濮阳市高等医学专科学校（筹），河南濮阳457000）



茶叶中大肠菌群检测方法的研究

武疆
（濮阳市高等医学专科学校（筹），河南濮阳457000）

摘要：本文以茶叶中大肠菌群为主要检测目标，利用国标法、LST法以及荧光法检测茶叶中大肠菌群总数，并比较三种检测方法的优劣，以期为相关研究者提供数据参考与理论支持。

关键词：有害生物；茶叶；大肠菌群；检测方法

据检测结果表明，我国现出口的茶叶产品中，有害生物的种类是沙门氏杆菌、大肠杆菌、黄曲霉毒素等，其中，沙门氏杆菌和大肠杆菌严重超标，黄曲霉毒素偶有检出。另外，茶叶产品中，出现微生物污染的情况也不尽如人意。对此，不仅我国茶叶生产部门应该重视并积极解决该问题，其他相关部门如销售部门、管理部门、检验检疫部门等也应该高度重视。尤其是检验检疫部门，应该不断加强检疫力度，积极做好各项检测试验。

1　材料与方法

1.1实验材料

试验材料：普洱、康砖、绿茶、包装绿茶、茉莉花茶。（所有试验用茶都必须根据茶叶的具体取样标准进行样品选取）

培养基：营养型琼脂培养基、蛋白胨葡萄糖培养基、蛋白胨水培养基、枸橼酸盐培养基、LST肉汤、BGLB肉汤、MUGal肉汤、乳糖发酵管、乳糖胆盐发酵管、伊红美蓝琼脂以及革兰氏染色剂。（LST肉汤和BGLB肉汤需要自行熬制、MUGal可直接购买）

器材用具：酒精灯、天平、培养皿、吸液球、盖玻片、载玻片、量筒、滤纸、纱布、漏斗、接种环、脱脂棉、温度计、玻棒、胶头吸管、试管、移液管、手术剪、250ml的烧杯、50ml、250ml、1000ml的三角烧瓶等。

实验器材：SW-CJ-1A型号的净化水平流工作台（江苏省净化设备有限公司）、B11.500-S恒温电热培养箱（江苏省常熟医疗仪器有限公司）、S.C 101-1电热鼓风干燥箱（上海市高机实业有限公司）、21CR6恒温电热水浴锅（广东医疗器械有限公司）、YXQ.SG41.280手提电热蒸汽压力消毒器（哈尔滨市松江医疗器械有限公司）、HZQQX全温度振荡器（上海市博讯事业医疗设备有限公司）、A13204-N分析天平（上海市第二天平有限公司）、LG-2.4A离心机（北京市医疗用具有限公司）、OLYMUPUS显微镜（Olymupus Co.LTD）、pHS-25型号的数字化PH计（上海市雷诺试验仪器有限公司）、HITACHIU-1800型号的分光光度计、BCD-216YH型号的海尔冰箱、SG-280型号的粉碎机、电炉等。

1.2试验方法

样品检验处理：在无菌操作下，利用粉碎机将各种类的取样茶叶打碎，然后利用无菌包装袋进行密封并有效保存。

测定茶叶样品中菌落总数：①选择并确定茶叶的实际稀释度：在无菌操作下，称各种类茶叶样品25g，利用粉碎机打碎后，放置于250ml的三角烧瓶中，分别加入225ml无菌水对其进行稀释，稀释至均质为10-1溶液。然后在以10倍的标准进行梯度稀释，分别稀释完成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6等六个梯度溶液。从每个溶液浓度中移取1ml，然后滴入平皿，将营养型琼脂倒入，放置进入恒温培养箱，温度设置在36℃正负1℃的范围内进行恒温培养。48h之后进行菌落数量观察，根据实际的菌落数选择并确定三个合适的稀释度。②测定菌落总数：在无菌条件下，根据最后确定的三个茶叶稀释度，各吸取1ml滴入培养皿，迅速倒入温度适合的营养型培养琼脂。对每个茶叶稀释度进行三次重复，然后放入温度设置在36℃正负1℃范围内的恒温培养箱中进行菌落培养。48h之后，再进行菌落观察并记录试验结果。

检验大肠菌群的方法：大肠菌群，其实是指要么具有某些特性，要么与粪便污染相关的一组或一群细菌。通常属于需氧型细菌或兼性厌氧型细菌，大多数在37℃时，能够将乳糖进行分解，并形成能够产酸也能够产气的无芽孢杆菌，并且这些菌都属于革兰氏阴性菌。故此，对大肠菌落进行检测时，都需要按照其既定定义进行。就目前来看，我国对进出口食物进行大肠菌落检测时采用的方法主要有三种，分别是国标法、LST法以及荧光法。

1.2.1国标法：即国家标准，通常采用三步法进行大肠菌落检测，分别是乳糖发酵、分离培养以及证实等试验。（1）乳糖发酵试验：在茶叶样品稀释完成之后，选择三个适宜的稀释度，在每一个稀释度上接种乳糖胆盐发酵管，每个需接种三管，放置进温度设置在36℃正负1℃范围内的恒温培养箱中培养46-48h。在此过程中，需要观察其是否有气体产生。（2）分离培养试验：对有气体产生的发酵管进行处理，将其对应培养物转移接种在伊红美蓝的琼脂平板之上，放置进温度设置在36℃正负1℃范围内的恒温培养箱中培养18-24h。在此过程中，需要不断观察其菌落的具体形态。（3）证实试验：对平板上相对可以的菌落进行深入分析，将其挑起进行革兰氏染色试验，观察具体情况。同时，对其进行乳糖发酵管接种，接种完成后放置于温度设置为36℃正负1℃范围内的恒温培养箱中培养22-26h。在此过程中，也必须观察其是否产气。

国标法检测完成之后，撰写报告时，必须证实大肠杆菌中阳性菌的具体管数。同时，还需要查询MPN表，将每100ml/g大肠菌群的实际MPN值进行核对并报告。

1.2.2LST法：即国家商业检疫局原来制定并采用的行业标准，与美国PDA制定并采用的标准方法效果相同。该方法主要包括两个试验，分别是推测和证实试验。（1）推测试验：对茶叶样品稀释完成之后，选择三个适应的稀释度，在每个稀释度上接种LST肉汤，每个需接种三管。接种完成之后，将培养皿放置于温度设置在36℃正负1℃范围内的恒温培养箱中培养46-50h。在此过程中，需要切实观察培养皿是否有气体产生。（2）证实试验：对有气体产生的LST肉汤管进行处理，在其培养物上接种BGLB肉汤管。接种完成之后，将其放置于温度设置为36℃正负1℃范围内的恒温培养箱中培养46-50h。在此过程中，同样需要切实观察培养皿是否有气体产生。

LST法检测完成之后，由于BGLB产生的气体为阳性，所以同样需要查询MPN表，将样品茶叶中每ml/g含有大肠菌群的实际MPN值。

1.2.3荧光法：即快速检测大肠菌群的标准，主要包括三个试验，分别是推测、对照、证实等试验。（1）推测试验：在双料管中滴加比例为1∶10的样品稀释溶液，重复三管；移取比例为1∶10的样品稀释溶液滴加到MUGal肉汤之中，重复三管；移取比例为1∶10的样品稀释溶液滴加到MUGal肉汤的单料中，重复三管。将所有试管放置于温度设置在37℃的恒温培养箱中培养24h。然后利用波长为366nm的紫外线进行照射，若呈现的荧光反应为兰色，则大肠菌群为阳性。（2）对照试验：设置一个空白对照的试管，在MUGal肉汤中加入无菌形态下的生理盐水，后续步骤按照推测试验进行。（3）证实试验：设置阳性和阴性的对照菌管各一个。阳性对照管为MUGal肉汤中滴加大肠杆菌，阴性对照管为MUGal肉汤中滴加沙门氏菌。将所有对照管放置进温度设置为37℃的恒温培养箱中培养24h。培养完成之后，将试验管放置于黑暗之处，用波长为366nm的紫外灯进行照射。如果荧光反应为兰色，则大肠菌群为阳性；如果荧光反应不是兰色，则大肠菌群为阴性。

荧光法检测完成之后，与国标法和LST法一样，同样需要查询MPN表，进行检测报告完成。

2　结果与分析

2.1茶叶样品中菌落总数的调查

不同种类的茶叶细菌总数进行抽样检查表明：茶叶产品整体情况较好。由上表可知：茉莉花茶和绿茶的茶汤在前三个稀释度中的菌落总数正随着这稀释度的递增而不断增加，且该趋势越发显著；而普洱和康砖则与之不同，在稀释度不断增加的同时，其茶汤稀释度中的菌落总数反而不断减少，但这一趋势变化具有一定程度的滞后性。该滞后性产生的原因可能是由于茶叶中存在多酚类物质。茶叶中存在的多酚类物质有较强的杀菌作用，故此，在高浓度的茶叶中，能够检测到细菌的总数会很少。另外，由于茶叶检测的意义在于低浓度茶叶样品中菌落总数的数值必须小于1％，所以，对茶叶中所含微生物进行计数时，选择的适宜稀释度应该为10-2、10-3以及10-4。

由试验的整体结果显示：所有茶叶样品的菌落总数均在2000cfu/ml至200000cfu/ml范围内。且按照茶叶所受污染的具体程度进行递减排序，各类茶叶的顺序为康砖＞普洱＞茉莉花茶＞绿茶＞包装绿茶。其中，由于普洱和康砖都是黑茶，且需要必要的发酵生产，所以受到微生物污染的侵染较为严重，其侵染途径也相对要比其他茶叶的途径多。另外，花茶属于再加工茶品，所以，受到微生物污染和侵害的途径也相对较多。由此，这几种茶的细菌总数相对绿茶而言，都较高。

2.2不同方法检测各类茶叶大肠菌落的对比分析

就传统的大肠菌落检测方法而言，其准备工作异常繁琐，且试验过程耗时较长，最少需72h。相比而言，荧光法只需24h，简单快捷。下图是国标法、LST法以及荧光法对茶叶中大肠菌落的具体检测结果：

虽然在统计学上，国标法和LST法与荧光法之间没有显著性差异，且LST法在茶叶大肠菌群的检测中具有很好的检出性，但是前两者检出的大肠菌群在数量上明显多过荧光法检出的。分析原因，是受到茶样中自身内含物影响或干扰所致，但都没有产生非特异性反应。另外，在试验过程中，出现有试管本身带有荧光的现象，这可能是由于试管本身没有清洗干净或是残留物等影响。除此之外，茶叶成分复杂，茶样颗粒较大、或坏死pH值过高等，都会对整个检测试验产生干扰。

参考文献

[1]王立波等.茶叶中大肠菌群检测方法初步比较[J].中国茶叶, 2010,07:19-20.

[2]陈利燕等.茶叶中大肠菌群的污染途径初探[J].中国茶叶加工, 2005,01:36-37.

作者简介：武疆（1982-），女，山西长治人，硕士，讲师，研究方向：生物学、微生物。