鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白及其疫苗的研究进展

韩玉婷，何 勇，许革学，朱艳平，马秀园，王选年,*

(1.河南科技学院 动物科学学院，河南 新乡 453003； 2.新乡学院 生物技术研究中心/生命科学与技术系，河南 新乡 453003； 3.灵宝市畜牧局，河南 灵宝 472542)

鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白及其疫苗的研究进展

韩玉婷1，何 勇2，许革学3，朱艳平2，马秀园1，王选年1,2*

(1.河南科技学院 动物科学学院，河南 新乡 453003； 2.新乡学院 生物技术研究中心/生命科学与技术系，河南 新乡 453003； 3.灵宝市畜牧局，河南 灵宝 472542)

传染性法氏囊病病毒(IBDV)是鸡传染性法氏囊病(IBD)的病原。近年来IBDV变异毒株和超强毒株的流行，严重威胁着世界养鸡业的发展，传统疫苗已不能控制IBDV的流行，迫切需要研制新型疫苗。IBDV VP2蛋白是重要的结构蛋白，能诱导机体产生中和抗体，因此，利用VP2蛋白制备IBDV重组疫苗成为国内外研究的热点。综述了IBDV VP2蛋白的作用及在不同表达系统中用VP2蛋白制备疫苗的研究进展，以期为IBDV新型疫苗的开发提供参考。

鸡； 传染性法氏囊病病毒； VP2蛋白； 疫苗

鸡传染性法氏囊病(IBD)是由鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的危害雏鸡的一种急性接触性传染病，主要感染鸡法氏囊的B淋巴细胞，造成感染鸡的免疫功能低下，从而引起免疫抑制。长期的免疫抑制可使鸡群易感染其他疾病，机体对各种疫苗的免疫反应下降，无法正常产生抗体，造成免疫失败。目前IBDV毒株主要包括经典毒株、经典减毒株、突变株和超强毒株[1-2]。但由于IBDV具有易变异、毒力返强的特点[3]，传统疫苗已不能阻断IBDV的传播[4-5]。同时，由于新毒株的不断发现，给IBDV的防治带来更大的挑战。Hernández等[6]通过对南美洲的IBDV毒株进行基因鉴定发现，南美洲毒株不同于已知的IBDV 的4种毒株，但该毒株是IBDV流行早期的1个典型毒株，目前已遍布全世界。Mohamed等[7]通过对印度分离的10个IBDV毒株进行基因鉴定，发现7个毒株属于IBDV 的超强毒株，其他3个毒株不同于欧洲流行株和亚洲流行株(包括日本和香港)，是印度独有的毒株，这可能是导致疫苗免疫失败的原因。因此，急需开发新的疫苗，用于预防IBDV新毒株的流行。由于VP2蛋白携带宿主保护性抗原决定簇，其可以诱导产生中和抗体，并有血清型特异性，是IBDV重要的结构蛋白[8]。因此，研究利用VP2蛋白制备疫苗，对防控IBDV以及开发新型疫苗具有重要意义。

1 IBDV基因组结构及VP2蛋白的作用

IBDV是一种无囊膜的RNA病毒，具有单层衣壳，呈二十面体立体对称，T=13晶格分布，病毒粒子直径约60 nm。由32个壳粒组成单层核衣壳，组成病毒核衣壳的结构蛋白主要以三聚体形式存在[8]。IBDV主要有2个基因片段组成，这2个基因段分别称为A和B。A片段由3 036个碱基组成，编码分子质量约为110 ku的前体多聚蛋白NH2-pVP2-VP4-VP3-COOH[9]，该多聚蛋白在翻译后进一步加工形成pVP2(aa 1—512)、VP4(aa 513—755)和VP3(aa 756—1012)[10]。pVP2在C末端有3个 alanine-alanine motifs [(T/A)XA↓A]结构，构成VP4裂解pVP2的作用位点，分别位于aa 487—488位、495—496位和501—502位。核衣壳形成过程中pVP2在感染细胞内形成成熟VP2(aa 1—441)和4条短肽[11-12]。VP2、pVP2及其4条短肽共同参与IBDV核衣壳的组装过程。成熟VP2的裂解位点位于aa 441—442，其裂解motif为439AGA↓F442，该motif与(T/A)XA↓A存在一定的同源性，表明VP4也参与了成熟VP2的形成。VP2构成IBDV的外壳，由454个氨基酸组成，占IBDV蛋白质总量的50%以上，是IBDV的主要抗原结构[13]。A片段的小阅读框架编码VP5蛋白。B片段编码所形成的VP1蛋白，由878个氨基酸残基构成，分子质量大小约为90 ku[14]。

VP2和VP3是组成IBDV病毒核衣壳的主要成分。核衣壳外表面由260个VP2三聚体形成凸状结构，约占病毒蛋白的51%，核衣壳的内表面由200个Y型VP3三聚体结构组成，约占病毒蛋白的40%[8]。VP2主要存在于核衣壳的外表面，携带病毒主要中和性抗原表位[15]，可诱导产生主要保护性中和抗体，是IBDV重要的结构蛋白。

2 IBDV VP2疫苗

2.1 IBDV VP2重组活载体疫苗

在基因工程活载体疫苗研究中，火鸡疱疹病毒载体、禽痘病毒载体、马立克病毒载体、禽腺病毒载体等基因工程重组活载体疫苗研究相对较多。Zanetti等[16]将2种IBDV毒株的VP2基因插入到火鸡疱疹病毒中，构建了2个重组病毒，1个不含外源启动子，另1个含外源启动子，将不同剂量的重组病毒同时免疫1周龄雏鸡，进行攻毒试验，不含外源启动子的重组病毒产生的中和抗体水平比较低，IBDV仍能感染雏鸡，带有外源启动子的重组病毒免疫雏鸡能够诱导机体产生较高的中和抗体水平，保护雏鸡不受IBDV的感染。将IBDVVP2基因插入到禽痘病毒中构建重组病毒，并用重组蛋白注射1周龄雏鸡，攻毒后发现，免疫鸡可免于死亡，但法氏囊组织会有所损伤，不能起到完全的保护作用。将IBDVVP2基因克隆至SV40启动子调控下的马立克氏病毒(MDV)的US2位点，成功研制IBDV-MDV重组疫苗，能够保护55%的鸡群免受超强毒株攻击，未出现法氏囊组织损伤[17]。目前IBDV重组活载体疫苗研究仍存在许多问题，导致疫苗免疫效果差，有很多方面原因，如启动子的强弱，插入的外源基因对病毒载体的影响，基因转录与否，重组蛋白能否被正确加工、修饰，重组疫苗的适用性等。因此，IBDV活载体疫苗的研制仍需要大力开展。

2.2 IBDV VP2核酸疫苗

核酸疫苗实质是将外源基因插入到真核质粒表达载体上，直接注射重组质粒至动物体内，外源基因在动物体内表达，并刺激动物机体免疫系统产生中和性抗体。Jackwood等[18]成功构建了IBDV的A片段表达质粒并免疫鸡群，鸡群未出现法氏囊萎缩现象，阻止了IBDV的侵入。因此，IBDVVP2基因的DNA疫苗能够诱导鸡群进行免疫应答，这为临床上IBDV疫苗的研究明确了方向。核酸疫苗的研究虽然取得了一些进展，但受到毒株变异、表达量、疫苗的适用性等方面的制约，这一方向仍需要开展大量的研究工作。

3 IBDV VP2蛋白在不同表达系统的表达

IBDV VP2蛋白作为IBDV主要中和保护性抗原，国内外获得VP2重组蛋白的外源表达系统主要有大肠杆菌表达系统、哺乳动物细胞表达系统、干酪乳杆菌表达系统、竹花叶病毒表达系统、鸡痘病毒表达系统以及家蚕杆状病毒表达系统等。

由于大肠杆菌表达系统无法对蛋白质进行加工、修饰，且VP2蛋白属于三聚体，全基因表达时表达量很低。因此，使用大肠杆菌表达系统进行VP2重组蛋白的表达需要改进措施。例如，由于VP2高变区不在N端，去除N端亲水区(约20～80个氨基酸)，提高蛋白质表达量，但全基因原核表达产量仍仅为7%～10%[19]。此外，使用BL21 PLUS(含稀有密码子)宿主菌能提高蛋白质表达量。由于BL21宿主菌无法进行蛋白质的加工、修饰，通过其表达获得的VP2蛋白免疫原性差，并且获得的VP2蛋白大部分是以包涵体形式存在。这些因素限制了在大肠杆菌中表达的IBDV VP2蛋白进行广泛使用。

为了获得免疫原性好的IBDV VP2重组蛋白，Dieye等[20]将IBDV VP2片段成功转入杆状病毒表达载体系统中，将表达产物免疫鸡群，能够保护部分雏鸡免受IBDV的侵入，但不能保护法氏囊组织免受损伤。林红丽等[21]通过基因重组技术将IBDV致弱株的A片段重组于家蚕杆状病毒转移载体中并转染家蚕细胞，表达产物能够诱导家蚕产生免疫中和抗体。目前，通过杆状病毒表达系统获得的重组蛋白制备的疫苗与传统疫苗相比，存在一定的缺陷，限制了其在临床生产中的应用[22]。

目前，酵母表达系统是研究VP2蛋白利用较多的外源系统，Gao等[23]利用酵母表达系统成功高效表达获得了IBDV超强毒株的主要保护性抗原蛋白，研制的IBDV亚单位疫苗具有良好的安全性和免疫效力。Zhang等[24]应用酵母表达系统表达VP2蛋白的表达量为0.459 mg/mL。经聚丙烯酰胺凝胶电泳、免疫印迹以及动物试验表明，表达的重组蛋白具有IBDV天然蛋白的生物活性和免疫原性。Macreadie等[25]用酵母表达IBDV大片段，获得的重组蛋白免疫鸡，刺激机体产生高水平的ELISA抗体和中和抗体，免疫鸡血清可保护雏鸡。Fahey等[26]用酵母表达的IBDV VP2蛋白免疫鸡，不同时期均产生高的抗体水平。

以上结果表明，酵母表达系统获得的IBDV VP2蛋白免疫效果比传统疫苗好。同时，酵母表达系统简单方便，成本低，表达产物易于纯化，重组VP2蛋白可以正确折叠并进行糖基化作用，具有天然蛋白所应有的生物学活性。因此，用酵母表达生产的IBDV亚单位疫苗有很好的应用前景。

4 展望

目前，预防IBDV最有效的方法是应用传统经典毒株的弱毒疫苗和灭活疫苗免疫雏鸡，但是由于环境中IBDV超强毒株及变异株的存在，IBDV对环境的抵抗力又比较强，传统疫苗往往达不到有效预防IBDV的效果。用超强毒株的灭活油乳剂疫苗免疫产蛋种鸡，可以诱导产生较高的母源抗体，保护雏鸡在一定时间内免受强毒感染，但是较高的母源抗体可以中和弱毒疫苗，造成雏鸡弱毒疫苗的免疫失败。因此，检测雏鸡的母源抗体水平，确定最佳首免时间，成为预防鸡IBD发生的关键。同时，制备能够刺激机体产生广泛的、高水平的IBDV抗体的疫苗也在IBDV预防中发挥重要作用。目前，关于IBDV疫苗的研究集中在IBDV VP2蛋白上，期望通过不同的表达系统获得免疫活性最好的蛋白质用于疫苗的开发研究。酵母表达系统具有明显的优势，可以作为VP2蛋白的表达系统，进行疫苗的开发。

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Research Progress on VP2 Protein and Vaccine of Infectious Bursal Disease Virus

HAN Yuting1,HE Yong2,XU Gexue3,ZHU Yanping2,MA Xiuyuan1,WAGN Xuannian1,2*

(1.College of Animal Sciences,Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China; 2.College of Life Science and Technology/Center for Biotechnology Research,Xinxiang University,Xinxiang 453003,China; 3.Lingbao City Bureau of Animal Industry,Lingbao 472542,China)

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a pathogen causing chicken infectious bursa disease (IBD).Due to the variation of IBDV strains and the prevalence of super virus in recent years,IBD become a serious disease that may threat to the development of the world chicken industry.The traditional vaccine is unable to resist the prevalence of IBD,and new IBD vaccine is urgently needed to control the spread of IBDV.As an important structural protein of IBDV,VP2 protein is used to prepare recombinant vaccine.It is an investigative hot spot for home and abroad experts.In this overview,the IBDV VP2 protein function and the research progress of using VP2 protein to prepare vaccine in different expression system were summarized,so as to provide reference for the development of new IBDV vaccines.

chicken; IBDV; VP2 protein; vaccine

2015-07-19

新乡市科技创新平台项目(CP1311)

韩玉婷(1989-)，女，河南濮阳人，在读硕士研究生，研究方向：分子免疫学与细胞病理学。 E-mail:97259058@qq.com

*通讯作者：王选年(1969-)，男，河南灵宝人，教授，博士，主要从事动物病理学与分子免疫学研究。 E-mail：wangxuannian@163.com

S855.3

A

1004-3268(2016)03-0020-04