鸭瘟病毒UL6基因的原核表达及多克隆抗体的制备

吴 双，马丽丽，朱善元，陆 辉*

(1.江苏农牧科技职业学院，江苏 泰州 225300； 2.甘肃农业大学 动物医学院，甘肃 兰州 730070)

鸭瘟病毒UL6基因的原核表达及多克隆抗体的制备

吴 双1，马丽丽2，朱善元1，陆 辉1*

(1.江苏农牧科技职业学院，江苏 泰州 225300； 2.甘肃农业大学 动物医学院，甘肃 兰州 730070)

为制备鼠抗鸭瘟病毒(DPV)UL6基因的多克隆抗体，采用PCR方法扩增出UL6基因，连接原核表达载体pET-32a(+)，构建表达质粒pET-UL6，并将其转化大肠杆菌BL21(DE3)，于37 ℃经1.0 mmol/L的IPTG诱导4 h，SDS-PAGE检测融合蛋白的表达情况，将目的蛋白免疫Balb/c 小鼠，利用ELISA方法检测特异性抗体效价。结果显示，构建的原核表达质粒经IPTG诱导能正确表达，且表达的重组蛋白能与DPV阳性血清反应，制备的多克隆抗体效价可达1∶16 000。表明，制备的多克隆抗体具有良好的免疫原性，可以用于UL6基因的表达检测。

鸭瘟病毒；UL6基因； 原核表达； 多克隆抗体

鸭瘟(duck plague，DP)是由鸭瘟病毒(duck plague virus，DPV)引起的养鸭业一种传染性极强、败血性、高度致死性传染病。任何品种、年龄和性别的鸭均可被感染，并且部分病愈康复鸭仍可带毒并周期性向外排毒，所以导致该病在鸭群中广泛传播，从而严重影响养鸭业的发展。此外，DPV还可感染鹅、天鹅和其他多种雁行目成员，成为世界范围内水禽养殖业危害较为严重的疫病之一[1]。

DPV是α-疱疹病毒亚科成员之一，其基因组为双股DNA，大小约为150 kb。基因组分为特定长区(UL)和特定短区(US)，UL和US连接处有内部重复序列(IR)，基因组两端含有末端重复序列(TR)[2]。DPV中UL6基因高度保守，其编码的UL6蛋白在DNA的切割和包装、形成核酸进出衣壳的通道、衣壳的成熟、对入侵病毒产生特异性免疫应答等方面发挥着重要作用[3]。目前，关于DPV UL6蛋白的研究较少。为此，本研究对UL6基因进行原核表达，并制备了多克隆抗体，以期为DPV致病机制的研究提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 毒株、载体、菌种和试验动物 DPV标准毒株购自中国兽医药品监察所；Balb /c 小鼠购自扬州大学比较医学中心；pGEM T-easy 载体、pET-32a(+)载体购自Promega 公司；大肠杆菌Trans5α和BL21(DE3)感受态细胞均购自北京全式金生物技术有限公司。

1.1.2 主要试剂 TIANamp病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；琼脂糖凝胶DNA 回收纯化试剂盒、X-Gal、IPTG、T4 DNA ligase购自宝生物工程(大连) 有限公司；限制性内切酶、DNA Marker和预染蛋白质Marker购自Fermentas 公司；考马斯亮蓝G-250、2×LAmp Master Mix、SDS-PAGE电泳试剂盒、质粒小提试剂盒、HRP-羊抗鼠IgG、ELISA显色试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司；其他试剂均为市售分析纯。

1.1.3 引物的设计与合成 参考GenBank中登录的鸭瘟病毒(DPV)UL6基因组序列运用Primer premier 5.0软件设计1对PCR引物(表1)，并在引物上、下游分别添加了BamH Ι、SalΙ酶切位点，由上海英潍捷基生物技术有限公司合成。

表1 引物序列

1.2 方法

1.2.1 病毒DNA的提取 参照TIANamp病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒说明书提取DPV标准毒株的DNA，取2 μL样品用紫外分光光度计测定其纯度及浓度，少量分装，于-80 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 目的片段扩增及重组质粒pET-UL6的构建 以提取的DPV DNA为模板扩增UL6基因。反应条件为：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，30个循环；72 ℃延伸5 min。采用1.2%的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，并回收纯化目的片段，最后与pGEM T-easy 载体连接，转入Trans5α感受态细胞，涂布在含100 μg/mL的氨苄青霉素LB平板上，挑取37 ℃过夜培养单菌落，将菌落PCR鉴定正确的菌液提取质粒后进行酶切鉴定，然后将酶切鉴定正确的质粒经BamH Ⅰ、SalⅠ酶切后，与经同样双酶切的pET-32a(+)连接，转入BL21(DE3)感受态细胞，最后将酶切鉴定正确的菌液送至上海英潍捷基生物技术有限公司测序，将测序正确的重组质粒命名为pET-UL6。

1.2.3 UL6重组蛋白的诱导表达 将pET-UL6接种于含100 μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，将过夜培养的新鲜菌液以1∶100的比例转接种，37 ℃振荡培养至OD600值约0.6时，加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG诱导4 h，离心收集菌体，溶于适量PBS中，超声波裂解的菌体进行12%分离胶的SDS-PAGE电泳以检测重组蛋白的表达情况。并对IPTG浓度及诱导时间等条件进行优化。

1.2.4 UL6重组蛋白Western blot检测 将收集的诱导后重组菌和非重组菌进行SDS-PAGE电泳后，电转印至硝酸纤维薄膜(NC膜)上，以DPV阳性血清为一抗，HRP-羊抗鼠IgG为二抗进行Western blot检测。

1.2.5 UL6重组蛋白多克隆抗体的制备 将上述SDS-PAGE电泳产物用0.5 mol /L KCl 染色，切下乳白色目的条带回收，使用凝胶成像系统的定量软件对其进行定量分析，放入有少量PBS的研钵中研磨匀浆化，以每只小鼠100 μg的剂量颈背部皮下多点注射免疫Balb/c小鼠，每隔10 d免疫1次，4免后3 d加强免疫1次，3 d后眼眶静脉采血，分离血清，ELISA方法检测抗体效价。

2 结果与分析

2.1 重组质粒pET-UL6的构建与鉴定

扩增UL6基因的PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳分析，出现与预期大小一致的目的片段，约310 bp(图1)。产物回收后与pGEM T-easy 载体连接，经转化后酶切鉴定，阳性质粒与经同样酶切的pET-32a(+)连接，获得重组质粒pET-UL6，酶切鉴定出现5 900 bp和310 bp 2个条带(图2)，测序结果表明，UL6基因克隆正确且无突变。

2.2 UL6重组蛋白的诱导表达

同时将pET-32a(+)载体转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞诱导及未诱导的受体菌作为阴性对照。结果表明，IPTG浓度为1.0 mmol/L，37 ℃诱导4 h时，UL6重组蛋白以较高水平表达，并存在于上清中。UL6重组蛋白的分子质量约为22 ku(图3)，与理论值相符。

M.DNA Marker; 1.UL6基因

M.DNA Marker; 1.pET-UL6双酶切

图2 pET-UL6的BamHⅠ和SalⅠ双酶切鉴定结果

M.预染蛋白质Marker; 1.未诱导的载体菌上清; 2.未诱导的载体菌沉淀; 3.经诱导的载体菌上清; 4.经诱导的载体菌沉淀; 5.未诱导的重组菌上清; 6.未诱导的重组菌沉淀; 7.经诱导的重组菌上清; 8.经诱导的重组菌沉淀图3 重组蛋白UL6的SDS-PAGE分析

2.3 UL6重组蛋白Western blot检测结果

从图4可以看出，重组蛋白可与DPV阳性血清发生反应，在约22 ku处出现特异性反应条带，且大小与目的蛋白相一致，而对照菌则无特异性条带出现，证明表达的重组蛋白具有良好的反应原性。

2.4 UL6重组蛋白多克隆抗体效价测定结果

将免疫小鼠后采集的血液离心分离血清作为一抗，以诱导表达的蛋白为抗原，1∶5 000稀释的HRP-羊抗鼠IgG为二抗，ELISA方法测得其抗体效价为1∶16 000。

M.蛋白质分子量标准； 1.BL21( pET-UL6)蛋白；2.pET-32a(+)全菌蛋白对照图4 目的蛋白Western bolt分析结果

3 结论与讨论

目前，鸭瘟已成为危害我国水禽养殖业健康有序发展最严重的疫病之一[4-7]。因此，研究该病毒主要结构蛋白及其体外表达，对深入研究病毒感染的分子作用机制，有效防控病毒性传染病的发生与流行，保护和促进养鸭业的健康发展具有非常重要的意义。

针对外源基因的表达，常用的表达系统有原核细胞系统和真核细胞系统[8]。本试验所选择的大肠杆菌原核表达系统具有宿主菌生长迅速、周期短、成本低，与宿主菌相适应的表达载体具有lacUV5启动子，可获得高效表达，并且目的蛋白大多以融合蛋白形式存在等诸多优点[9-10]，成为外源基因表达的首选系统。但该系统也存在一定的不足：当蛋白质的凝聚速率高于重组蛋白正确折叠速率时，重组蛋白表达产物不易形成正确的空间构象，常以包涵体的形式存在，或者重组蛋白在表达过程中缺少必要的酶或辅助因子，但这也基于重组蛋白的高效表达[11]。

鸭瘟病毒囊膜蛋白暴露在病毒颗粒的表面，是其主要的保护性抗原，且UL6基因在不同毒株中具有高度的保守性[12]。因此，可以利用UL6基因编码的无毒外源蛋白研制一种亚单位疫苗。本试验采用切胶免疫的方法，将蛋白质胶研磨匀浆后注射Balb/c小鼠。其依据是凝胶也具有佐剂的缓释作用，可以作为一种特殊的佐剂。并且与过柱纯化相比，该方法的优点是纯度高、杂带少[13]。但该方法的缺点是回收量比较少，切胶研磨后损失较大，需多次电泳切胶才能达到免疫剂量。

本试验将UL6基因先克隆入pGEM T-easy载体，再与原核表达载体pET-32a(+)连接，有效提高了PCR产物的克隆效率。然后经终浓度为1.0 mmol/L的IPTG 37 ℃诱导4 h后，UL6重组蛋白获得了高效表达。将重组蛋白电泳后切胶回收，免疫Balb/c小鼠，制备了多克隆抗体。ELISA结果显示，制备的多克隆抗体能够特异性识别UL6重组蛋白，且效价达到1∶16 000，说明本试验制备的多克隆抗体具有良好的免疫原性，为进一步研制鸭瘟病毒诊断试剂奠定基础。

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Prokaryotic Expression and Polyclonal Antibody Preparation of Duck Plague VirusUL6 Gene

WU Shuang1,MA Lili2,ZHU Shanyuan1,LU Hui1*

(1.Jiangsu Animal Husbandry and Veterinary College,Taizhou 225300,China; 2.College of Veterinary Medicine,Agricultural University of Gansu,Lanzhou 730070,China)

To prepare mouse anti-duckUL6 of duck plague virus polyclonal antibodies,a pair of specific primers were designed,UL6 gene was amplified by PCR,the fragment of theUL6 gene was cloned into the prokaryotic expression vector pET-32a(+),the resultant recombinant plasmid pET-UL6 was constructed and transformed intoE.coliBL21(DE3).Optimally expressed under the induction of 1.0 mmol/L IPTG at 37 ℃ for 4 hours.SDS-PAGE analysis showed that the UL6 protein was successfully expressed, and it could be recognized by DPV positive serum. After Westernblot identification,the antiserum against UL6 protein was produced by immunizing Balb/c mouse with recombinant protein.ELISA results showed that the antibodies titer was 1∶16 000.In this research,UL6 gene was successfully expressd inE.coli，the immunogenicity of the polyclonal antibodies was good,and the antiserum could be used for detection ofUL6 gene expression.

duck plague virus;UL6 gene; prokaryotic expression; polyclonal antibody

2015-09-22

国家自然科学基金项目(31440083) ;江苏省科技支撑计划——农业部分项目(BE2012366)

吴 双(1983-),女,江苏徐州人,副教授,博士,主要从事动物传染病防控和流行病学研究。 E-mail:jswushuang@sina.cn

*通讯作者：陆 辉 (1975-),男,江苏海门人，副教授,硕士,主要从事生物工程技术研究。E-mail:smluhui@163.com

S855.3

A

1004-3268(2016)03-0141-04