复合益生菌在水产养殖中的作用机制研究进展

陈树河，陈 秋，常云胜，周 维，王青华，丁 燏*(.广东海洋大学 水产学院/广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室,广东 湛江 54088； .湛江市麻章区动物卫生监督所，广东 湛江 54088)

复合益生菌在水产养殖中的作用机制研究进展

陈树河1，陈 秋2，常云胜1，周 维1，王青华1，丁 燏1*
(1.广东海洋大学 水产学院/广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室,广东 湛江 524088； 2.湛江市麻章区动物卫生监督所，广东 湛江 524088)

复合益生菌在水产养殖业已得到广泛应用，并取得了良好的效果。但目前对复合益生菌作用机制的认识尚不够深入，研究和分析复合益生菌的作用机制有助于进一步发挥其应用潜力。因此，主要从净化养殖水质、抑制有害病原、增强动物免疫力和减轻应激反应等几个方面探讨了复合益生菌在水产养殖中的作用机制，并概述了当前该领域中存在的问题及其解决对策，同时还对其应用前景进行了展望。

复合益生菌； 水产养殖； 作用机制

随着水产养殖业的快速发展，水产养殖环境不断恶化。近年来频繁暴发的水产动物疫病，制约着水产养殖业的健康发展。此外，抗生素的长期滥用导致水产养殖中的耐药菌株不断出现，严重破坏养殖水体中的微生物生态平衡。自然界存在着各种各样的有益菌，如枯草芽孢杆菌、硝化细菌、乳酸菌和酵母菌等，具有改善养殖环境和促进水产动物生长发育的作用[1-4]。若将2种或2种以上的不具拮抗作用的有益菌混合制成复合益生菌，各菌株通过功能上的协同互补，其作用相比单一菌株更明显。鉴于此，主要从净化养殖水质、抑制有害病原、增强动物免疫力和减轻应激反应等方面综述了复合益生菌在水产养殖中的作用机制，以期为其应用研究提供参考。

1 复合益生菌净化养殖水质的作用机制

1.1 降低水体氨氮含量

氨氮分子会引起细胞DNA的断裂以及造成细胞膜的破坏，导致动物细胞死亡[5]。因此，养殖水体中的氨氮分子对水产动物的生存和生长所造成的危害不容忽视。研究表明，以硝化细菌、假单胞菌和芽孢杆菌组成的复合益生菌，能显著降低氨氮含量及亚硝酸盐浓度，起到净化养殖水质的作用[6]。有研究发现，上述3种菌都具有一定降解氨氮分子的作用[7-8]，硝化细菌降解能力优于假单胞菌和芽孢杆菌[9-10]。由此推测，硝化细菌可能为优势菌，在复合益生菌降解氨氮过程中起着主导作用。然而，复合益生菌中硝化细菌的种类和数量并非越多越好。研究发现，硝化细菌群(亚硝化细菌、硝化细菌、反硝化细菌等) 组成的复合益生菌T1增加水体溶氧量、降低氨氮和亚硝态氮含量等效果明显不如以硝化细菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌、乳酸菌和光合细菌组成的EM复合益生菌T3[11]。这说明复合益生菌降解氨氮的功效并不是仅仅取决于单一的优势菌株，而是取决于复合益生菌中有益菌之间共生或协作关系的强弱。红螺菌和乳酸菌也具有较强的降解氨氮分子的能力[12-13]。王莹等[14]发现，以红螺菌、乳酸菌、枯草芽孢杆菌和克雷伯氏菌AN-4组成的复合益生菌G4，其降低铵态氮浓度和亚硝酸盐含量的效果，不如以枯草芽孢杆菌和克雷伯氏菌AN-4组成的复合益生菌G3，这可能是由于红螺菌、乳酸菌和枯草芽孢杆菌及克雷伯氏菌AN-4之间存在种间拮抗所致。此外，有益菌的不同配比对复合益生菌的氨氮降解能力也有影响。以不同比例的芽孢杆菌和乳酸杆菌制成的复合益生菌，其降低水体中氨氮的效果存在着明显的差别[15]。其原因可能是有益菌的比例不同，影响了优势菌形成的先后顺序，最终导致复合益生菌在降解氨氮的能力上表现出差异。

1.2 降解水体硫化物

硫化物对水产动物具有一定的毒性[16-18]。研究发现，以发硫菌、贝日阿托氏菌和绿硫细菌组成的复合益生菌具有去除硫化物的功效[19],这是由于其中的硫细菌具有从硫化物中获得电子将其氧化为元素硫的能力[20]。硫细菌在降解硫化物的过程中所涉及的酶多种多样[21]，其中以硫化物氧化酶所起的作用最为重要。据报道，硫化物氧化酶在芽孢杆菌中也有发现[22]，说明该酶并不是硫细菌独有的，也存在于其他有益菌中。朱将伟[23]研究表明，以枯草芽孢杆菌、沼泽红假单胞菌(硫细菌的)、干酪乳杆菌和啤酒酵母组成的复合益生菌能很好地降解硫化物。由此推断，上述复合益生菌可能通过枯草芽孢杆菌和沼泽红假单胞菌的硫化物氧化酶发挥降解硫化物的作用。此外，干酪乳杆菌和啤酒酵母的菌体内亦可能存在相同或类似的酶系统，这为开发和研制其他具有除硫功效的复合益生菌提供了一定的启示。

2 复合益生菌抑制有害病原的作用机制

研究发现，许多有益菌均能分泌抑菌物质以拮抗病原体的生长繁殖[24-26]，乳酸杆菌的抑菌效果最显著[27]。范国歌等[28]研究表明，复合益生菌加入乳酸菌后能明显增强其抑菌能力，推测乳酸菌可能作为优势菌发挥了主要的抑菌作用。在人类病原离体试验中发现，由乳酸菌群(嗜酸乳杆菌W70、干酪乳杆菌W56、唾液乳酸杆菌W24、乳酸乳球菌W58、双歧杆菌W23和婴儿双歧杆菌W52)组成的复合益生菌Ecologic 641较单一的乳酸菌更能显著抑制引起胰腺坏死的病原体[29]，这可能是由于乳酸菌群较单一菌株能产生更多的细菌素、有机酸、过氧化氢等抑菌物质[30]，从而发挥更强的抑菌作用。这也表明，复合益生菌的抑菌能力与乳酸菌的种类数量呈正相关。但乳酸菌作为兼性厌氧细菌，氧气对其具有一定的毒害作用[31]。因此，需要提高乳酸菌的抗氧胁迫能力，才能最大限度地发挥复合益生菌的抑菌效果。潘雷等[32]以大菱鲆(Scophthalmusmaximus)幼鱼为研究对象,研究在饲料中添加不同组合的复合益生菌对其肠道菌群的影响，发现以乳酸菌和芽孢杆菌组成的复合益生菌较复合乳酸菌能显著降低大菱鲆肠道弧菌总数，这可能是由于芽孢杆菌定植大菱鲆肠道后，在迅速耗尽其肠道内氧气的同时，上调了乳酸杆菌抗氧胁迫相关基因的表达量所致。

微囊藻能产生具有强烈生物毒性的微囊藻毒素(microcystins，MCs)[33]，对水产动物危害严重。马晶等[34]研究表明，EM复合益生菌(主要成分为酵母菌、乳酸菌和芽孢杆菌等)能显著抑制微囊藻的增殖，其作用机制可能是酵母菌通过分泌胞外产物破坏了微囊藻的叶绿素[35]，从而发挥抑藻作用；同时乳酸菌所代谢的产物可为酵母菌提供能量和物质基础[36]，进一步增强其抑藻能力；其次，芽孢杆菌除了创造适合乳酸菌生存的低氧环境外，其分泌的抗生素等物质[37]对微囊藻也具有一定的毒害作用。可见，菌株间的联合协作，发挥了EM复合益生菌的抑菌能力。因此，在配制复合益生菌以控制水产病害时，要考虑各菌株的种间关系。需要注意的是，由于菌株间的协同效应以及有益菌和微囊藻之间的互作需要一定的时间，在实际生产中EM复合益生菌应在微囊藻大暴发之前使用，以争取足够的时间使其菌株成为优势菌。此外，EM复合益生菌中有较多的好氧有益菌，故使用该复合益生菌时应注意补充养殖水体中的氧气。在养殖水体发生严重缺氧的情况下，不建议使用EM复合益生菌。

3 复合益生菌增强动物免疫力的作用机制

3.1 增强非特异性免疫

在动物的非特异免疫过程中，非特异性免疫细胞如吞噬细胞所发挥的作用十分关键。研究发现，硬骨鱼在接种疫苗后，其脾、肾及肝脏等主要的免疫器官内吞噬细胞的数量显著提高[38]，这说明吞噬细胞在硬骨鱼类的非特异免疫过程中扮演着主要的角色。Salinas等[39]研究发现，由枯草芽孢杆菌和戴耳布吕克氏乳杆菌组成的复合益生菌与单一的枯草芽孢杆菌或戴耳布吕克氏乳杆菌相比，显著增加金头鲷(SparusaurataL.)头肾白细胞的吞噬活性。研究表明，枯草芽孢杆菌能显著提高野鲮(Labeorohita)体内的粒细胞和单核细胞数量[40]，乳酸菌也能增强其巨噬细胞的活性[41]。据此推测，菌株的种间协作通过上调金头鲷非特异性免疫细胞的数量和活性增强了其非特异性免疫。Iwashita等[42]研究表明，由米曲霉、酵母菌和枯草芽孢杆菌组成的复合益生菌能显著提高罗非鱼(Oreochromisniloticus)白细胞的数量，降低由嗜水气单胞菌和链球菌引起的死亡率。米曲霉发酵所产生的腺苷酸脱氨酶(adenylic deaminase，ADA)可刺激免疫细胞的分化[43-44]，酵母细胞壁中的甘露寡糖(mannose-rich oligosaccharides，MOS)除了具有免疫激活的功能外，还可以作为枯草芽孢杆菌的能源物质[45-46]。上述3种菌株可能通过自身的代谢产物和活动对罗非鱼起到了保护作用，但具体作用机制有待进一步研究。

3.2 增强特异性免疫

浆细胞所分泌的免疫球蛋白(IgM)作为动物特异性免疫的重要指标，在鱼类的特异性免疫过程中起着最主要的作用[47]。Salinas等[48]发现，芽孢杆菌和乳酸菌不仅可以上调水产动物吞噬细胞的数量和活性，且与单一的芽孢杆菌或乳酸菌相比，由以上2种有益菌组成的复合益生菌能显著上调金头鲷的总血清IgM水平和肠道IgM+细胞数量。吞噬细胞除了吞噬功能外还具有抗原呈递的作用[49]，可见芽孢杆菌和乳酸菌通过协同作用激活了金头鲷的吞噬细胞，提高其IgM的生成量。相似的研究表明，以枯草芽孢杆菌、乳酸菌和酿酒酵母组成的复合益生菌在提高野鲮的IgM水平的同时，也使髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)的活性显著增加[50]。由于MPO为巨噬细胞所分泌的标志酶[51]，表明复合益生菌能通过激活吞噬细胞而加强水产动物的特异性免疫应答。

3.3 调节细胞因子

细胞因子(cytokine，CK)具有增强抗原呈递和活化T淋巴细胞等重要生理作用[52]，从而介导和调节机体的非特异性和特异性免疫应答。Zhuo等[53]从草鱼(Ctenopharyngodonidellus)肠道提取分离出希瓦氏菌A-1(ShewanellaxiamenensisA-1)、希瓦氏菌A-2(ShewanellaxiamenensisA-2)以及维氏气单胞菌A-7(AeromonasveroniiA-7)，并以此为原料分别制成单一有益菌制剂和复合益生菌制剂，并对草鱼进行投喂试验。结果显示，复合益生菌较单一有益菌制剂能显著降低由嗜水气单胞菌引起草鱼的累积死亡率(仅为26.67%)。同时发现，在投喂试验的前期(第7天和第14天)，复合益生菌较单一有益菌更能显著上调草鱼白细胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)的水平，但在试验后期(第21天和第28天)两者无显著差异。其原因可能在于，在投喂试验的前期，有益菌作为外来异物启动和上调了草鱼的免疫相关基因，引起IL-1β的合成，且复合益生菌较单一有益菌能引发草鱼体内更为强烈的免疫应答。但IL-1β只能在有益菌刺激的初期发挥免疫效应，在试验后期随着草鱼适应有益菌在其肠道内的定植，IL-1β基因的表达量恢复到正常水平。目前对于复合益生菌如何调节水产动物细胞因子的具体机制仍不清晰。但草鱼累积死亡率与其IL-1β水平有着密切的关系，值得进一步研究。由于复合益生菌在一定程度上是以抗原形式诱发和增强动物机体的免疫，因此，在水产动物严重患病或其他免疫力低下的情况下使用复合益生菌有可能取得与预期相反的结果，在实际生产中应以预防使用为主。

4 复合益生菌减轻应激反应的作用机制

超氧化物歧化酶(SOD)具有使活性氧自由基(ROS)发生歧化的能力[54]，产生的H2O2则由过氧化氢酶(CAT)进一步催化成氧和水[55]。水产动物受到环境胁迫时，应激反应会导致自身产生一定量的ROS，体内这2种酶的活性会升高以保持氧化和抗氧化的平衡[56]。研究发现[57]，以枯草芽孢杆菌、酵母菌及乳酸菌制成的不同组合的复合益生菌，均能不同程度地促进暴露于戊酸氰醚酯(杀虫剂的一种)环境中的野鲮的生长，下调其肝脏、腮组织内SOD、CAT的活性。其中，同时均以添加上述3种有益菌的复合益生菌促进野鲮生长和下调其SOD、CAT活性的综合效果最好。芽孢杆菌具有降解多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)的能力[58]，酵母菌也能把环烃(alkane hydrocarbon) 当作碳源物质[59]，故推测这2种有益菌通过种间协作分解了水体中的戊酸氰醚酯，减轻了环境对野鲮的胁迫，使其体内ROS的生成量降低。此外，研究表明，乳酸菌具有调节抗氧化基因的表达能力[60]。因此，复合益生菌加入乳酸菌后，能显著提高野鲮的抗胁迫能力，使其重要器官内的SOD和CAT活性稳定在正常范围内。

对水产动物而言，水温亦为常见的环境胁迫因子。以野鲮为例，其最适生长温度为31～33 ℃[61]，超出这个范围会出现一定程度的温度胁迫，不利于其生长发育。Mohapatra等[62]分别用添加复合益生菌(以枯草芽孢杆菌、乳酸菌和酿酒酵母组成)的基础饲料和未添加复合益生菌的基础饲料投喂野鲮，并检测其在不同温度下的生理生化指标。结果表明，在高于33 ℃的环境中，复合益生菌不仅能显著提高野鲮体质量，还能明显降低其热休克蛋白70(HSP70)的活力。高温胁迫可诱导作为动物应激反应标志的HSP70分泌以防止细胞损伤[63-64]，但该过程也会加速机体能量物质的代谢[65]，反而不利于动物的生长。由此可知，复合益生菌可能通过调节HSP70 mRNA合成和表达而起到降低HSP70活力的作用，从而减轻野鲮在高温胁迫中的应激反应[66]。但目前关于这方面的研究报道较少，复合益生菌减轻动物应激反应的具体作用机制还有待进一步考证。

5 复合益生菌应用中存在的问题及解决途径

5.1 目前存在的问题

目前有关复合益生菌研究的报道仍非常少，在有益菌株筛选和配伍上缺少参考，因此存在着较大的盲目性。有益菌之间的相互拮抗作用，容易导致菌株发生衰退，使复合益生菌的稳定性降低、效果不明显，限制了其在水产养殖上的进一步应用。

5.2 解决途径

要解决上述问题，关键是要弄清复合益生菌中各种有益菌的代谢途径和特点，了解菌株间的关系。因此，要进一步加强菌株筛选与配伍等方面的研究，建立体外或体内的动物模型，对复合益生菌中的有益菌及其作用对象进行定性定量分析，从而阐明各有益菌及其作用对象之间的互作关系。根据有益菌的底物和产物的类型，判断菌株之间的生态位是否存在冲突或重叠，菌株之间是否互相拮抗，为复合益生菌的配伍提供一定的理论依据。

6 展望

综上所述，复合益生菌已广泛应用于水产养殖，从而起到了净化养殖水质、抑制有害病原、增强动物免疫和减轻动物应激反应的作用。复合益生菌的各组成(单一有益菌)之间的联合协作效应，是其功能发挥的基础和关键所在。因此，有益菌的配比是否合理，直接决定了复合益生菌能否在水产养殖上发挥其最大的功效。

随着研究的进一步深入，复合益生菌的作用机制将会越来越清晰，其制备也必将更加科学合理，其应用效果也会更加迅速和稳定。研究发现，复合益生菌中加入中草药[67]、酶类[68]等其他物质，可以进一步加强复合益生菌的作用，这将成为研发复合益生菌的趋势。

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Research Advance on Application Mechanisms of Multispecies Probiotic in Aquaculture

CHEN Shuhe1,CHEN Qiu2,CHANG Yunsheng1,ZHOU Wei1,WANG Qinghua1,DING Yu1*
(1.Fisheries College,Guangdong Ocean University/Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals,Zhanjiang 524088,China；2.Zhanjiang Mazhang Animal Health Supervision,Zhanjiang 524088,China)

Multispecies probiotic have been widely used and achieved good results in aquaculture.However,the mechanisms of multispecies probiotic are still not entirely clear at present.The study and analysis of the mechanisms of multispecies probiotic could fulfill their application potential.In this review,not only the mechanisms of multispecies probiotic in various aspects such as purifying water quality,inhibiting pathogens,enhancing animal immunity and reliving the stress response of aquaculture were explored roundly,but also the present problems and solutions in this field were summarized.Moreover,the new trends and prospects of multispecies probiotic in application in aquaculture were also discussed.

multispecies probiotic； aquaculture； application mechanism

2015-11-06

“创新强校工程”2013年省奖补资金支持建设项目——高校重大科研项目培育计划项目(第3类)(GDOU2013050207)

陈树河(1989-)，男，广东肇庆人，在读硕士研究生，研究方向：海洋生物学。E-mail:cshgdou@163.com

*通讯作者：丁 燏(1971-)，男，湖北监利人，教授，博士，主要从事海洋微生物与水产病害研究。 E-mail：dingy@gdou.edu.cn

S949

A

1004-3268(2016)04-0012-07