异常黏液质成熟剂颗粒对APP/PS1转基因小鼠行为学和海

塔依尔?吐尔松 买吾拉尼江?依孜布拉 买地尼也提?尼亚孜 等

摘要：目的 观察异常黏液质成熟剂颗粒对APP/PS1转基因小鼠空间学习记忆、海马CA1区组织病理形态学变化的影响，探讨其作用机制。方法 选取3月龄APP/PS1转基因模型小鼠并将其随机分为模型组、阳性药组和异常黏液质成熟剂高、中、低剂量组，每组18只。另取18只3月龄C57BL/6J小鼠作为正常组。各给药组给予相应药物灌胃，连续6个月。Morris水迷宫实验观察小鼠学习和记忆能力；HE染色光镜下观察海马CA1区病理形态；透射电镜观察小鼠海马CA1区有髓神经髓鞘、微管、微丝。结果 水迷宫实验结果显示，模型组小鼠逃避潜伏期时间较正常组明显延长（P<0.01），空间搜索实验穿越原平台位置次数较正常组明显减少（P<0.01）；与模型组比较，异常黏液质成熟剂除低剂量组第1日外其余各剂量组小鼠逃避潜伏期明显缩短（P<0.05，P<0.01），异常黏液质成熟剂低、高剂量组小鼠经过有效区域次数明显增加（P<0.05，P<0.01），异常黏液质成熟剂各剂量组小鼠原平台所在象限停留时间明显增加（P<0.01）。HE染色显示，异常黏液质成熟剂各组小鼠脑组织海马CA1区，锥体细胞层完整性稍好，细胞排列整齐，形态正常，均匀分布；电镜观察，与模型组比较，异常黏液质成熟剂各组小鼠海马CA1区神经元核形不规则，核膜清楚，染色质清晰，核仁明显，细胞基质均匀，细胞器丰富，分布均匀，线粒体嵴明显，粗面内质网和游离核糖体多见。结论 异常黏液质成熟剂颗粒可改善APP/PS1转基因小鼠空间学习记忆能力，减轻神经元超微结构受损。

关键词：异常黏液质成熟剂颗粒；APP/PS1转基因小鼠模型；空间学习记忆；海马CA1区

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.04.011

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）04-0041-04

Effects of Abnormal Phlegmatic Temperament Granules on Behavioristics and Hippocampus Pathomorphism of APP/PS1 Transgenic Mice TURSUN Tayerjan1， HIZBULLA Mawlanjan1， NIYAZI Maidiniyeti2， SHAWUTI Shadike3， AMAT Nurmuhammat1 （1. Uygur Medical School， Xinjiang Medical University， Urumqi 830011， China； 2. First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University， Urumqi 830011， China； 3. Affiliated Chinese Medicine Hospital of Xinjiang Medical University， Urumqi 830000， China）

Abstract： Objective To investigate the effects of Abnormal Phlegmatic Temperament Granules on spatial learning and memory， histopathology morphological change in hippocampus CA1 zone； To discuss its mechanism of action. Methods Three-month-old APP/PS1 transgenic mice were randomly divided into 5 groups： model control group， positive control （donepezil 0.92 mg/kg） group， Abnormal Phlegmatic Temperament Granules high-， medium-， and low-dose groups （3， 2， 1.5 g/kg）， 18 mice in each group. Another 18 three-month-old C57BL/ 6J mice were chosen as normal control group. All administration groups received relevant medicine for successive 6 months. Then the changes in learning and memory ability of mice were detected by Morris water maze test； pathomorphism in hippocampus CA1 zone was detected by HE staining method； changes of myelin sheath， microtubule， and

基金项目：教育部新世纪优秀人才计划（NCET-11-1073）

通讯作者：努尔买买提·艾买提，E-mail：Oglan1972@126.com

microfilament in myelinated nerve of hippocampus CA1 zone were detected by electron microscope. Results Morris water maze test results showed that escape incubation period of APP/PS1 transgenic mice was significantly longer than the normal control group （P<0.01）， and the original platform time was significantly shorter than normal control group （P<0.01）； compared with model control group， Abnormal Phlegmatic Temperament Granules treatment groups escape latency time was significantly reduced （P<0.05， P<0.01）. Space experiments and escape incubation period of Abnormal Phlegmatic Temperament Granules high-， medium-， low-dose groups were significantly shortened （P<0.05， P<0.01）， and spatial searching test showed that the times of mice in Abnormal Phlegmatic Temperament Granules high-， medium-， low-dose groups passing through effective area increased （P<0.01）. The integrity of HE staining pyramidal cell layer in the hippocampus CA1 zones of Abnormal Phlegmatic Temperament Granules high-， medium-， and low-dose groups was relatively good； cells arranged orderly； distribution was normal. Electron microscopic observation showed that compared with model control group， the hippocampus neurons nuclear had irregular shape； nuclear membrane was clear and complete； chromatin was clear； nucleolus was obvious； cell matrix was uniform； organelles were abundant； mitochondrial cristae was obvious； endoplasmic reticulum and free ribosomes were obvious. Conclusion Abnormal Phlegmatic Temperament Granules can improve spatial learning and memory in APP/PS1 mice， alleviate neuronal ultrastructure damage and ultimately improve cognitive function.

Key words： Abnormal Phlegmatic Temperament Granules； APP/PS1 double transgenic mice model； spatial learning and memory； hippocampus CA1 zone

阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD），是以记忆力丧失、认知功能障碍为主要临床特征的神经退行性障碍疾病。近年来，AD的患病率和死亡率呈上升趋势，加之晚期AD患者常伴有严重认知功能障碍和精神异常症状，由此带来的社会、家庭、经济及公共卫生问题将会越来越严重。AD属维医中异常体液导致的“失忆”“失眠”“愚蠢”“遗忘”等范畴。在早期的轻度认知功能障碍期，异常黏液质在临床表现中占主要的地位[1]。临床上异常黏液质成熟剂对AD早期疗效较好。本实验观察该药对APP/PS1转基因小鼠空间学习记忆能力和海马CA1区组织病理形态学变化的影响，探讨其作用机制。

1 实验材料

1.1 动物

SPF级APP/PS1转基因AD模型小鼠90只，雄性，3月龄，体质量23～27 g；SPF级C57BL/6J小鼠18只，雄性，3月龄，体质量23～27 g；北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号SCXK（京）2009-0004。小鼠饲养于新疆医科大学实验动物中心，饲养环境为SPF级。

1.2 药物

异常黏液质成熟剂颗粒由新疆医科大学维吾尔医学院提供；盐酸多奈哌齐片，卫材（中国）药业有限公司，批号061653928914，使用前粉碎，用蒸馏水溶解。

1.3 主要试剂与仪器

苏木素-伊红染液、4%多聚甲醛、50%戊二醛和白色素，南京建成生物有限公司。MT-200Morris视频分析和跟踪系统（成都泰盟科技有限公司），100 ℃水浴锅（常州国华电器有限公司），BS-1105型电子天平（北京赛多克斯天平有限公司），CX-3双目显微镜（日本OLYMPUS公司），DM300图像采集系统（德国Laica公司），1230透射电镜（日本JEOL公司）。

2 实验方法

2.1 分组及给药

将90只转基因小鼠随机分为模型组、异常黏液质成熟剂高、中、低剂量组和阳性药组，每组18只；同时以18只同月龄C57BL/6J小鼠作为正常组。依据异常黏液质成熟剂的临床应用剂量换算成小鼠给药剂量，即异常黏液质成熟剂低、中、高剂量组分别按1.5、2、3 g/（kg·d）灌胃异常黏液质成熟剂颗粒，阳性药组予0.92 mg/（kg·d）多奈哌齐灌胃，正常组和模型组予等量生理盐水灌胃，给药体积1 g/0.1 mL。各组小鼠给药6个月后，做行为学实验。实验阶段所有小鼠均正常饮食、饮水，每日1次。

2.2 行为学检测

水迷宫实验测试包括定位航行实验和空间搜索实验。定位航行实验持续4 d，记录每只小鼠60 s内找到平台的时间，每日4次，不同象限入池，当小鼠上到平台后终止5 s记录，休息10～20 min后进行第2次实验。空间搜索实验记录小鼠60 s内停留于原始平台位置的时间，观察并记录小鼠通过原始平台位置的次数[2]。

2.3 组织形态学检测

行为学检测结束后快速脱颈处死小鼠并取脑组织，贴上标记，投入含20%蔗糖多聚甲醛固定液后固定24 h以上。室温下切片，经二甲苯Ⅰ5 min→二甲苯Ⅱ10 min→无水乙醇→95%乙醇Ⅰ→95%乙醇Ⅱ→80%乙醇，水洗，苏木素染10 min，盐酸乙醇分化，水冲洗回蓝，伊红染5 min后水洗，再由低至高乙醇脱水，封片，光镜下观察海马CAl区病理形态。

2.4 细胞超微结构检测

取海马CA1区脑组织，切成1 mm3，放入4%戊二醛固定液内固定2 h，PBS冲洗10 min×3次→1%锇酸固定2 h→PBS冲洗10 min×3次→脱水→包埋，制成超薄切片，染色后透射电镜观察。

3 统计学方法

采用SPSS19.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，多组间比较采用方差分析，组间比较采用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 异常黏液质成熟剂颗粒对APP/PS1转基因小鼠空间学习记忆能力的影响

定位航行实验模型小鼠逃避潜伏期时间较正常组明显延长（P<0.01），异常黏液质成熟剂除低剂量组第1日外其余各剂量组小鼠逃避潜伏期时间较模型组明显缩短（P<0.05，P<0.01）；空间搜索实验模型组小鼠穿越原平台位置次数较正常组明显减少（P<0.01）；与模型组比较，异常黏液质成熟剂低、高剂量组小鼠经过有效区域次数明显增加（P<0.05，P<0.01），异常黏液质成熟剂各剂量组原平台所在象限停留时间明显增加（P<0.01）。结果见表1、表2。

4.2 异常黏液质成熟剂颗粒对APP/PS1转基因小鼠脑组织海马CA1区细胞形态学的影响

光镜观察正常组小鼠HE染色锥体细胞核排列整齐，海马神经元结构完整，形态正常，分布均匀，数量较多，核异染色质少，颜色浅，胞体胞浆淡蓝色，细胞核核仁大而清楚，胞质丰富，无核固缩或溶解现象，核膜清晰，可见少量神经胶质细胞，但无胶质细胞增生的情况；模型组小鼠HE染色可见神经元数目减少、变性、坏死，锥体细胞排列紊乱，细胞缩小，核固缩，形态无规则，胶质细胞增生；阳性药组小鼠HE染色锥体细胞核排列整齐紧密，海马神经元结构完整，数量较多，形态正常，分布均匀，核异染色质少，颜色浅，胞体胞浆淡蓝色，胞质丰富，无核固缩或溶解；异常黏液质成熟剂低剂量组小鼠HE染色仍见锥体细胞带紊乱、变细，细胞体积缩小，细胞间隙大，与模型组比较有所改善；异常黏液质成熟剂中剂量组小鼠HE染色可见少量分散的神经元凋亡细胞，神经元数量增多，锥体细胞紊乱减少，细胞体积增大、核固缩减轻；异常黏液质成熟剂高剂量组小鼠HE染色见细胞排列整齐，锥体细胞层较完整，形态正常，结构紧密，分布均匀，胞体胞浆淡蓝色，细胞核大而清楚，胞质丰富，可见少量的神经元固缩状坏死，核膜清晰，可见少量的神经胶质细胞，但无胶质细胞增生的情况。结果见图1。

4.3 异常黏液质成熟剂颗粒对APP/PS1双转基因小鼠脑组织海马CA1区细胞超微结构的影响

透射电镜观察正常组小鼠海马神经元核圆形，核膜完整清晰，染色质清晰，核仁明显，细胞基质密度均匀，细胞器丰富，均匀分布，线粒体嵴清晰可见，有丰富的粗面内质网和游离的核糖体；模型组小鼠神经核形状不规则，可见异染色质和核仁边集，细胞基质密度稍微降低，部分线粒体微肿胀、线粒体基质密度降低，粗面内质网扩张；阳性药组小鼠海马神经元核圆形，核膜清楚完整，染色质细腻，部分神经元细胞核形不规则；细胞基质密度均匀一致，细胞器丰富，均匀分布，线粒体嵴清晰可见，有丰富的粗面内质网和游离的核糖体，粗面内质网稍扩张；异常黏液质成熟剂低剂量组小鼠神经元细胞核形状极不规则，异染色多，细胞基质密度略降低，个别线粒体轻微肿胀、空泡变，粗面内质网扩张；异常黏液质成熟剂中剂量组小鼠海马神经元核圆形，核膜清楚完整，染色质细腻，核仁明显，细胞基质密度均匀一致，细胞器丰富，均匀分布，线粒体形态基本正常，游离核糖体多，内质网略扩张，细胞可见少量脂褐素；异常黏液质成熟剂高剂量组小鼠海马神经元核形不规则，核膜完整清晰，染色质清晰，核仁明显；细胞基质密度均匀，细胞器丰富，均匀分布，线粒体嵴清晰可见，有丰富的粗面内质网和游离的核糖体。结果见图2。

5 讨论

AD是一种与年龄相关、不可逆的神经退行性疾病，以渐进和永久失去学习记忆能力为主要特点，最初呈现轻度认知功能障碍，逐渐发展到严重的记忆功能缺损[3]，疾病后期常常出现抑郁、焦虑和易怒等异常精神症状[4]，其病因包括APP、PS1基因的突变[5]。AD引起的神经元损害已经被认可是一种重要的病理特征，在研究和开发转基因小鼠的过程中起重要的作用[6]。

治疗AD的常用西药有胆碱酯酶抑制剂、抗Aβ治疗的分泌酶抑制剂、非甾体类抗炎药、神经营养因子类药物等，但这些药物尚无任何一种可完全有效治疗AD。维医认为，大脑是湿寒性脏器，黏液质属性也是湿寒，其中涩味黏液质是黏液之中混入黑胆质的异常体液，分量重、质地稠，作为大脑病理产物在大脑中沉淀，从不同途径和（或）不同程度上损伤神经组织，影响正常细胞生理功能，易于形成神经阻滞，进而引起相应的神经功能障碍和AD等神经系统疾病。异常黏液质成熟剂具有成熟异常黏液质、消炎解毒等功效。该药药性干热，成熟异常黏液质体液，纠正由异常黏液质导致的人体机能的异常状态，以维持人体体液的相对平衡。

本实验研究结果显示，通过异常黏液质成熟颗粒治疗后，定位航行实验小鼠逃避潜伏期时间明显缩短。空间搜索实验小鼠经过有效区域次数增加，提示异常黏液质成熟剂颗粒可有效地改善APP/PS1转基因小鼠的空间学习和记忆能力。病理观察结果显示，异常黏液质成熟剂颗粒可改善组织结构受损的脑神经细胞，减少细胞损伤，降低神经纤维缠结的程度和老年斑的形成，减轻神经元细胞的受损，减轻粗面内网和游离核糖体的损伤。提示异常黏液质成熟剂能改善APP/PS1转基因小鼠脑内神经元线粒体、突触的结构损伤。

参考文献：

[1] 新疆维吾尔自治区卫生厅中国医学百科全书维吾尔医分卷办公室. 中国医学百科全书：维吾尔医学分卷[M].乌鲁木齐：新疆人民卫生出版社，1985：17-25.

[2] MORRIS R. Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat[J]. J Neurosci Methods，1984，11（1）：47-60.

[3] 帕丽丹·吾术尔，买吾拉尼江·依孜布拉，努尔买买提·艾买提，等.阿尔茨海默病异常黑胆质病证结合大鼠模型血清代谢组学研究[J].科技导报，2014，32（28/29）：39-47.

[4] 邱昕，陈国华，冯佩，等.黄连解毒汤对APP/PS1双转基因AD小鼠海马区病理形态学及脑内tB-APP基因表达的影响[J].神经损伤与功能重建， 2010，5（6）：404-408.

[5] 哈木拉提·吾甫尔，党明，热娜古丽·艾则孜，等.异黑颗粒对APP/PS1双转基因模型小鼠学习记忆和抗氧化能力的影响[J].科技导报，2013， 31（14）：26-29.

[6] OANA C， Lucian H， Marius M， et al. Cognitive-enhancing and antioxidant activities of inhaled coriander volatile oil in amyloid β（1–42） rat model of Alzheimer's disease[J]. Physiology & Behavior，2013，120（15）：193-202.