用药指导鱼类抗菌肽的研究进展

文/王玉堂

作者单位：全国水产技术推广总站

用药指导鱼类抗菌肽的研究进展

文/王玉堂

在治疗动物的细菌性、病毒性等疾病过程中，某些病原体会逐渐对药物产生较强的耐药性（抗药性）而无法有效治疗或控制。研发新型抗生素的周期长（一般为30年）、难度大、费用高，而且因水产养殖业中抗生素耐药菌株的出现速度远超过抗生素的研发速度，且现有的抗生素开发策略多局限于既有的抗生素类别，难以有实质性的突破。抗感染形势的严峻性迫切需要寻找出与现有的抗生素机理完全不同的新型抗菌物质。

抗菌肽的发现，尤其是抗菌肽对耐药致病菌有良好的杀灭或抑制作用，为治疗相关疾病提供了一个新的途径。抗菌肽是广泛存在于细菌、植物、软体动物、两栖类动物、鱼类、鸟类和哺乳动物体内的一类小分子多肽，由20个～60个氨基酸残基组成。抗菌肽具有活性强、功能广泛、广谱杀菌作用，在应用研究中有重要价值，这一新领域已引起越来越多研究者的关注。抗菌肽合成的速度非常快，与以恒定速度合成的肽键相比，抗菌肽的生产比IgM快100多倍，因此称抗菌肽是机体理想的第一道防线，目前已有多个鱼类抗菌肽基因不仅被分离出来，在活体内还对其进行了表达。

一、鱼类抗菌肽的生化特点和组成

鱼类抗菌肽是鱼体内一类小分子蛋白质，其组成和结构复杂多样，分子量大小和氨基酸组成各不相同，但它们具有一定共同的特点，如含有较多的半胱氨酸，形成较保守的α-螺旋结构；含有较多的阳离子氨基酸如精氨酸或赖氨酸等而使分子带正电荷。根据其生化和结构特点，可将它们分成若干类型：

第一类：富含某种氨基酸的线性抗菌肽。此种类型的抗菌肽因富含一些碱性氨基酸而带正电荷，与细菌细胞膜相互作用时可以折叠成有利于穿膜的疏水或双亲性α-螺旋结构，能选择地作用于细菌外层细胞膜的某些部分，如带阳离子的磷脂，增大其渗透性而杀死或抑制细菌的生长。这类分子还包括来源于虹鳟血清的salmocidin；八目鳗小肠的HFIAPs（hagfishintestinalantimicrobialpeptides）；分离自泥鳅的misgurin；来源于杂交斑纹鲈皮肤、鳃和血液肥大细胞的piscidins以及分离自美洲拟鲽和豹鳎体有粘液的pleurocidins和pardaxins等，其中BrocalI，Falco A等人从刺泥鲽的皮肤粘液中分离出一种25氨基酸的线性抗菌肽pleurocidin（Ple），具有与其它许多抗菌肽类似的两亲性α-螺旋结构鲈鱼的皮肤和鳃可表达分泌的moronecidin抗菌肽。鲈鱼moronecidin前体有79个氨基酸残基，由信号肽、成熟肽和C片段3部分组成，氨基酸残基数分别为22、22和35。经圆二色谱分析其结构呈α-螺旋。

第二类：含多个半胱氨酸分子内形成环状的抗菌肽类，这类抗菌肽由于含多全半胱氨酸而形成多个二硫键，从而使其二级结构呈β折叠。这类分子包括来源于罗非鱼的hepcidin和从克海七鳃鳗的皮肤上分离到富含半胱氨酸和精氨酸的多肽LCRP（lampreycorticostatin-relatedpeptidi）等，其中hepcidin基因大概含有20个～25个氨基酸残基，内部有8个高度保守的半胱氨酸，形成4个分子内二硫键，它有3个外显子和2个内含子，其中有1个长为273bp的ORF顺序，编码1个含有90多个氨基酸残基的前多肽原；前多肽原包含3个区域，信号肽、成熟肽和由40个氨基酸残基构成的前hepcidin原。罗非鱼hepcidin原类型目前报道有3种，分别命名为TH1-5、TH2-2和TH2-3，前体肽分别有88、86和91个氨基酸残基，相对分子量分别为9.5、9.4和9.8ku；三信号肽裂解位点分别位于第24～25、第22～23和第24～25密码子上，在共同的保守区域，都含有8个半胱氨酸。罗非鱼中的TH2-3和日本鲽鱼的JF2相似，TH2-2和日本的JF1相似，TH1-5和鲷的hepcidin类似；通过晶体结构模型表明，在半胱氨基酸部位都形成二硫键。从斑马鱼分离到的β-defensins有3种，分别命名为zfDB1、zfDB2和zfDB3。与哺乳动物β-defensins相同，三者的成熟肽都有6个半胱氨酸，形成3个二硫键，并形成的模式一致，即第1～5、第2～4和第3～6个半胱氨酸。结构都呈β折叠，但zfDB1的N端有1个α-螺旋结构。

第三类：组蛋白样抗菌肽（histone-likeproteins，HLPs）。这类肽在水生动物中仅发现于鱼类中，虾类、贝类中尚未见报道。如从鲶、斑纹鲈鱼、银大马哈和鲑等的皮肤粘液、鳃、血液和肝脏中分离的parasinI、HLPs和SAM等，氨基酸序列和质谱分析表明，它们与组蛋白H2A、H2B和H1非常相似。从大西洋鲑皮肤粘液中分离的SAMP H1（samonantimicrobialpeptideH1）含有30个氨基酸残基，中间富含Pro，N端乙酰基化，但对其抗菌活性没有影响；理论上的相对分子量为2836u。经色谱分析，其活性形式比非活性形式分子结构上显得紧凑和更具刚性。从鲋鱼红细胞上分离得到的一种特异蛋白H1与SAMPH1的氨基酸顺序有78%的同源性，有3个信号肽切割位点，是鲋鱼红细胞上一种新发现的抗菌肽。从鲶鱼受伤皮肤粘液分离得到的parasinI是由H2A组蛋白酶cathepsinD在其N端Ser19-Arg20位置裂解作用后产生的一种抗菌肽。parasinI含有19个氨基酸残基，具有广谱抗菌活性。Jorge等从彩虹鲑鱼皮肤分泌物中分离提取了1种新的抗菌肽OncorhyncinⅡ，指出这种抗菌肽的前17氨基酸残基与来自彩虹鲑鱼组蛋白H1的前138～154个残基相同，并测得其分子量为719513Da。从而指出这个OncorhyncinⅡ抗菌肽是组蛋白H1的C末端69残基的片段。从鳕体表粘液中分离得到的几种抗菌肽活性因子，通过弱阳离子的交换色谱法和反相色谱层析技术，分离出来3种小肽，通过N端和C端氨基酸顺序分析和质谱分析，它们分别为核糖肽类L40（6397Da）、L36A（12340Da）、L35（14215Da）。

第四类：经酰胺化、糖基化修饰的抗菌肽。这类肽由核糖体合成后，在高尔基体浓缩、加工时，在相关酶的作用下脱掉C端1个或多个氨基酸，或再与一些糖基结合而成有活性的成熟肽。这类肽在虾类和一些海水鱼类中比常见。如从健康的南美白对虾血细胞和血浆中分离出了几种抗菌活性因子，通过酶剪切、Edman降解、质谱仪分析等方法以及从血细胞的cDNA库中进行cDNA克隆，测定序列，发现南美白对虾抗菌肽penaeidins具有其中一种肽的N端因形成焦谷氨酸而封闭；C端由于谷氨酸在成熟肽中被去掉而酰胺化等等。但由于它们的N一端富含脯氨酸。而C一端含有6个半胱氨酸组成的3个分子内二硫键，使它们的结构有别于其它类群的抗菌肽。还有从鲤体表粘液中分离出的27KD疏水蛋白和从真鲷、鳗鲡皮肤粘液中分离出的分子量分别为65KD、49KD和45KD3种抗菌肽也是经糖基化修饰的多肽。Jorge等从彩虹鲑鱼的皮肤中分离出的一种新的具有抗菌功能的核糖肽类，测得其分子量大小为667616Da，并指出，这种肽与40S的核糖体蛋白S30非常相似。Jorge等还从彩虹鲑鱼的血细胞中分离出的具有抗菌特性的活性片段，研究得出这种活性片段对热敏感，且能被蛋白酶所消化，从而推断这一活性片段为一种类似蛋白质的具有抗菌活性的天然成分。

二、鱼类抗菌肽的基因结构和功能

随着研究的深入，一些抗菌肽基因被陆续克隆。2006年，刘碧莲等根据GenBank中收录的鱼类抗菌肽hepcidin的DNA序列设计特定的引物，用RTPCR法从鳜鱼肝脏中克隆到hepcidin的cDNA，并构建Pmd18-Thepcidin载体进行序列测定和分析，结果表明，该cDNA长为381bp，其中第20～277位核基因的开放阅读框（ORP），编码86个氨基酸，形成由信号肽（24个残基）、前肽（42个残基）和成熟肽（20个残基）3部分序列组成的前体肽，与已报道的其它鲈形目鱼类hepcidin相比，核工业苷酸序列的同源性为72.2%～92.0%，所推导的成熟肽与包括人类在内的其他生物的hepcidin成熟肽的同源性在50%～86.4%，Park等经质谱和化学分析方法研究证实，8个保守的cys残基形成4个链内二硫键，分子呈发夹结构。4个链内二硫键可使β-折叠结构保持稳定。由CampagnaS，SaintN等人2007年从条纹纹鲈的肥大细胞里分离出Piscidin抗菌肽，他们通过采用脂分子双层的结构分析和电生理实验研究了这个包括22个氨基酸残基的阳离子肽的抗菌机制，圆二色性实验发现谱Piscidin在水中是无组织的，但却有1个高度紧密的alpha-helix，8个～17个氨基酸残基在微胞环境中具有alpha-helix，由于有界限清楚的疏水和亲水区域，这个分子有两亲性的特性。这种结构和那些能使细菌细胞通透性增强的阳离子肽的结构非常类似。Piscidin混合到偶氮植物凝血素二维的双分子层多通道实验发现，在不同的浓度下会出现1个Ⅰ-Ⅴ曲线，而且非常明确的表明肽分子能使细菌细胞膜通透。这个孔形成的活力通过单通道实验进一步证实了。离子通道的特性更加明确的表明了Piscidin通过螺旋的孔道结构更能使细菌透化，而不是通过“桶-桶板（barrel-stave）模型”。A.Falco等人从鲑科鱼类的EST数据库中调取了虹鳟β-防御素类抗菌肽的顺序称为c.mykissβdefensin-1（omBD-1），signalP3.0program分析发现，在omBD-1的19位后有1个假定的切割位点，切割位点后有1个含有41个氨基酸的前体肽和β-防御素共有的顺序一样，也有6个保守的cys残基，它和从其它鱼类中分离到的β-防御素类抗菌肽有85.7%的同源性，同人类有34.9%的同源性；omBD-1有1个+2价的阳离子，等电点为8，这有助于omBD-1与细菌细胞膜的结合。

近年来的研究重点在于向建立水生动物免疫特异性cDNA文库和表达序列标签（ESTs）方面转移，这将有助于发现更多的抗菌肽基因。Nam等地日本鲽鱼类的cDNA和ESTs文库，从中鉴定了许多免疫相关基因，如Mx蛋白基因、补体基因、干扰素调节基因等；从2种白对虾的ESTs中发现了44个免疫功能相关基因，全部免疫ESTs中，属于抗菌肽的ESTs数量占总数量的60%以上。可见抗菌肽的种类数目非常大，在水生动物中的分布也十分广泛。

三、鱼类抗菌肽的生物学活性与功能

鱼类抗菌肽，是鱼体非特异性免疫系统的重要组成部分。当鱼体受到损伤或受到病原侵袭时，能迅速产生抗菌肽以防御或杀伤病原微生物的入侵；其合成速度快，在体内扩散迅速而灵活的特点，是其它大分子蛋白质（如抗体）等和免疫细胞所不具备的。细菌和病毒对水产养殖业的影响越来越严重，而且没有一种有效的治疗药物来抑制病原体的感染，抗菌肽的鉴定和特点日益受到水产养殖业界的重视。编码Ple前肽原的基因组序列已经从刺泥鲽中分离出来，在无毒启动子的控制下成功克隆到载体上，通过这种结构，生物活性的Ple转化到鱼体细胞株上，并持续增长了2年多。对于Ple处理、加工、成熟、分泌（通过使用绿荧光蛋白融合技术）的研究，分泌的重组Ple抗菌肽具有很高的抗菌活性（在未经过浓缩的细胞悬液中发现），在此之前没有别的重组Ple抗菌肽或鱼体抗菌肽表达到这种程度。这样一个重组Ple抗菌肽或其它相关抗菌肽的过度表达可能会提高发现新的抗菌药物的机会。张宁应用分子生物学手段和生物信息学手段，通过化学合成从海马体内得到了足量的抗菌肽HKPLP。HKPLP对10种人和鱼类致病或条件致病菌株的活性实验表明，HKPLP对大多数的Gram〈+〉菌和Gram〈-〉菌都敏感，其最小抑制浓度（MIC）大多不超过16ug/ml，对白色念珠菌的MIC为32ug/ml，对铜绿色假单胞菌、副溶血弧菌和鳗弧菌等3株鱼类致病菌的作用较弱。尽管HKPLP对人红细胞有一定的溶血活性，但对大多数测试菌株有效抑制浓度下，溶血活性不超过20%。此外还发现HKPLP对Hela、U251和C6等几种致癌细胞有显著的细胞毒作用，IC〈50〉为18ug/ml～40ug/ml，且该作用发生迅速，可能与海马的抗肿瘤活性有关。

PanCY.ChanJY等人从鲈鱼鳃中分离得到的Epinecidin-1抗菌肽。鲈鱼Epinecidin-1的多克隆免疫组织化学分析表明，这种抗菌肽和它的抗体局限分布于鳃和小肠内。鲈鱼的2个合成肽g-Ple22-51和g-Ple22-42对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌都表现出强烈的抑菌活性。此外，在鲈鱼和罗非鱼体内注射弧菌属vulnificus后，抗菌肽通过处理能够显著增加鱼的存活量，这些结果对于研制鱼类病原感染的预防剂和治疗剂提供了一定的依据，特别是对鱼类的细菌感染中的免疫缺陷起到了改善作用。生长于极地海洋环境的鱼类，其血清具有高水平的抗冻蛋白（AFP）或抗冻糖蛋白（AFGP），能够通过阻止冰晶的形成而降低结冰温度，它成为第二个常用的外源基因，通过转AFP基因以提高受体鱼的抗冻能力。在鲽形目鱼类中发现了分子量较大的抗菌肽，它们具有相似的结构特征，均富含丙氨酸和α-螺旋结构。此分子的发现和对其结构与功能的深入研究，将可促进转抗冻蛋白基因鱼的培育进程。

四、抗菌肽在水产养殖业的应用前景

（一）研究开发鱼类抗菌肽的迫切性

近年来，随着工农业生产的发展和城市污水的大量排放，全球性水环境污染日益严重，水环境中的有机物和无机物富营养化、重金属离子和某些难发降解的农药等含量已超出水体的自净能力；同时，随着养殖业的快速发展，养殖密度不断升高，养殖动物的排泄物和残饵等积聚量也日益增加，进一步增加了水环境的污染程度，致使水产养殖动物病害频发，给我国水产养殖业造成了巨大损失。为控制水产养殖动物疾病的发生，在防治水生动物细菌性和病毒性疾病过程中大量使用抗生素类药物，不仅破坏了水环境的微平衡，还增强了某些病原微生物的耐药性，已近无法有效控制疾病的程度，严重制约了水产养殖业的健康可持续发展，养殖水产品的药物残留超标事件时有发生，不仅影响到消费者健康，也制约了产品国际市场的竞争力的提升。

因此，加快对主要水产养殖品种免疫防御的基础性研究，调动和开发养殖水生动物自身的免疫能力，是开展健康养殖，实现可持续发展的重要战略之一。水产动物抗菌肽的研究加深了人们对水生动物免疫防御机制的认识，为科学有效防治鱼病开辟了一条有效途径。同时随着转基因技术的发展，有可能通过转抗冻基因等获得抗病新品种。

（二）鱼类抗菌肽的应用前景

与抗菌素的单一作用位点不同中，抗菌肽是作用于细菌的整个细胞膜，使膜去极化或形成“孔洞”，造成细胞内含物外流或肽分子进入细胞内部，与DNA、RNA等靶标作用，进而杀死细菌。除高效杀菌作用外，抗菌肽还具有明显地杀伤真菌、病毒和原虫的作用，并能选择性杀伤肿瘤细胞而不破坏正常细胞，是生物天然免疫防御系统的重要组成部分。由于抗菌肽本身是来源于养殖动物自身的一种小分子蛋白，动物对其的排斥反应很低，而且杀菌作用发挥到一定程度后，动物体内的很多蛋白酶就把抗菌肽降解了，检测不到残留物质，对环境没有任何污染，是一种无毒、无害、绿色、环保的产品。另外，抗菌肽还具有不易出现耐药性突变、分子量小、热稳定性好、水溶性好、作用迅速等特点，它在水产养殖业中的应用，对提高鱼体免疫力，减少甚至杜绝抗生素类药物的使用，维持鱼体健康，实现水产养殖业的可持续发展具有重要的现实意义。

（三）抗菌肽的制备方法

一般而言，抗菌肽可以通过以下3种途径获得：一是从生物体内直接提取纯化；二是化学人工合成；三是采用基因工程技术构建抗菌肽基因工程株。但由于抗菌肽为体内诱导合成，生物体内的含量较低，从生物体中直接大量地提取难度较大，对技术和成本要求较高，难以规模化生产。而化学合成的方法同样存在成本较高的问题。一般小于10个氨基酸残基的多肽的合成较为经济，10个氨基酸残基以上的多肽合成会则很昂贵，限制了应用。因此，利用基因工程方法来生产抗菌肽是一条有效途径。

有关抗菌肽基因的表达研究，最初是在原核表达系统中进行，但由于抗菌肽对原核细胞有一定的毒性，因此，抗菌肽基因只能以融合蛋白形式在大肠杆菌中进行表达。近年来，以啤酒酵母、毕赤酵母、昆虫等为基因工程宿主进行表达、分离、纯化及应用的研究引起了专家学者的重视，为抗菌肽的开发与应用奠定了良好基础。

（四）抗菌肽的应用效果

目前已有越来越多的抗菌肽被克隆出来，品种涉及到鲶鱼、鲑鱼、罗非鱼、比目鱼、斑马鱼等多种鱼类。从已有的报道的序列来分析，它们的组成与结构复杂多样，且没有很高的同源性，但也存在着一些共同特征，如含有较多的精氨酸或赖氨酸而使分子带正电荷；含有较多的疏水氨基酸。可使分子折叠成疏水或双亲性α螺旋结构等。

体外研究表明，许多抗菌肽对鱼类特异性的甚至其他动物的病原微生物都具有杀伤活性，其最小抑菌浓度（MIC）多在毫摩尔水平，如鲶鱼和泥鳅抗菌肽对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌的MIC为0.5mmol/L～2mmol/L之间；鲈鱼的抗菌肽对杀鲑气单胞菌、嗜水气单胞菌等鱼类致病菌的MIC甚至低至1.2mmol/ L；此外，虹鳟和鲈鱼的抗菌肽对某些寄生虫也具有致死效力，但其杀伤作用需要较高的浓度，且其活性主要针对滋养体时期。

目前，国内作为饲料添加剂使用的抗菌肽主要是蚕抗菌肽AD——酵母制剂，大多数试验也是围绕这种抗菌肽进行的。黄永彤等发现抗菌肽对鸡有促进生长和提高免疫力的作用，与中草药、抗生素相比，在出栏率、平均个体重量及饲料利用率等方面均无显著差异，在出栏前3天停止投喂，抽检无残留。王广军等（2005）研究了抗菌蛋白在南美白对虾养殖中的应用效果，结果表明，在饲料中添加抗菌蛋白，无论是日生长率、相对增重、饲料系数及成活率、抗病能力方面均有显著提高。此外，因抗菌肽能有效杀灭霉腐微生物，在机体内还可以被蛋白酶降解，双重安全的保证使得抗菌肽还可以在饲料工业中作为防腐剂使用。

五、今后的研究重点

由于抗菌肽替代抗生素的研究是近几年才发展起来的，虽然取得了一定进展，但还处于探索阶段，距离技术成熟、大规模生产和应用到动物养殖中还有很多需要解决的问题。一是抗菌肽的种类很多，哪些种类可作为饲料添加剂使用时效果好，并且比较经济；二是不同种类的抗菌肽之间的相互作用情况；三是抗菌肽在动物体内的含量较少，天然资源匮乏，化学合成的成本太高，目前还无法实现规模化生产；需要从基因工程技术方法方面研究如何大规模生产抗菌肽问题，或通过日粮因素调控抗菌肽基因的表达；四是抗菌肽在动物体内容易被蛋白酶水解，需用脂质包被或对其进行化学修饰保护，这需要对其释放机制、受体结合、降解活性及其类似物的结构与活性等进行研究；五是目前人们对抗菌肽作为饲料添加剂真正在实际生产方面的试验还较少，其效果及是否有副作用还需进一步研究证实。

作者单位：全国水产技术推广总站