猪德尔塔冠状病毒的流行与防控

翁善钢

（外高桥出入境检验检疫局，上海浦东新区200137）

猪德尔塔冠状病毒的流行与防控

翁善钢

（外高桥出入境检验检疫局，上海浦东新区200137）

猪德尔塔冠状病毒（Porcine Deltacoronavirus, PDCoV），又称猪δ冠状病毒、猪丁型冠状病毒。它是这几年新发现的一种猪病病毒，也是引起仔猪腹泻的一种重要病原体。

1 病原学

冠状病毒（Coronavirus,Cov）属于套式病毒目（Nidovirales）冠状病毒科（Coronaviridae）。冠状病毒的宿主范围较广，包括鸟类、人以及其它哺乳动物[1]。自从2003年严重急性呼吸综合征（Severe acute respiratory syndrome,SARS）暴发以来，冠状病毒受到高度重视，不断有新的冠状病毒被发现，如近年来出现的中东呼吸综合征冠状病毒（Middle east respiratorysundrome coronavirus,MERS-CoV）。

2011年，国际病毒分类委员会（ICTV）第9次报告中将冠状病毒分为α、β、γ以及新假定的一个属（即δ）。冠状病毒共4个属。α和β冠状病毒属主要由哺乳动物冠状病毒组成，γ冠状病毒属主要包括鸟类冠状病毒，而δ冠状病毒属既包括哺乳动物冠状病毒，也含有鸟类冠状病毒。与其它3个属相比，人们对δ冠状病毒属的了解还非常少。δ冠状病毒最早于2007年从亚洲豹猫和中国白鼬獾群中检测到[2]。2014年，猪δ冠状病毒在美国被成功分离，动物试验证实PDCoV对仔猪具有较强的致病性，成为研究δ冠状病毒的良好模型。目前，δ冠状病毒属主要包括亚洲豹猫冠状病毒（Asian leopard cats Coronavirus,ALCCoV）、中国白鼬獾冠状病毒（Chinese ferret badger Coronavirus,CFBCoV）、猪δ冠状病毒、绣眼鸟冠状病毒（white eye Coronavirus,WECoV）、麻雀冠状病毒（Sparrow Coronavirus,SPCoV）、鹊鸲冠状病毒（Magpie robbin Coronavirus,MRCoV）、夜鹭冠状病毒（Night heron Coronavirus,NHCoV）、野鸭冠状病毒（Wigeon Coronavirus,WiCoV）、黑水鸡冠状病毒（Common Moorhen Coronavirus,CMCoV）以及夜莺冠状病毒（bulbul Coronavirus,BuCoV）、鹅口疮冠状病毒（Thrush Coronavirus,ThCoV）、文鸟冠状病毒（Munia Coronavirus,MunCoV）。

根据目前已经测定的PDCoV全基因组序列，病毒基因组大小约为25.4 kb，是所有冠状病毒中基因组最小的，GC含量约为43%。PDCoV基因组的组成、排列与其它冠状病毒类似，两端包含两个较短的非编码区（Untranslated region,UTR），即5'-UTR和3'-UTR。5'端2/3的基因组编码两个大的重叠的开放阅读框（Open reading frame,ORF）ORF1a和ORF1b，分别编码两个多聚蛋白pp1a和pp1ab。基于其它冠状病毒非结构蛋白的组成并通过生物信息软件预测，PDCoV的多聚蛋白pp1a和pp1ab可能被切割、加工、形成15个成熟的非结构蛋白（Nonstructural proteins,Nsps）。这些Nsps主要是与病毒复制转录有关的蛋白酶，包括Nsp3（木瓜蛋白酶，PL－pro）、Nsp5（糜蛋白酶，3CLpro）、Nsp12（RNA依赖的RNA聚合酶，RdRp）、Nsp13（解旋酶，Hel）以及其它未知功能的蛋白。PDCoV基因组3'端主要编码病毒的结构蛋白，依次包括表面纤突蛋白（Spike,S）、小膜蛋白（Small membrane,E）、膜蛋白（Membrane,M）以及核衣壳蛋白（Nucleocapsid,N）。

在冠状病毒的结构蛋白基因之间或内部，常常存在一些小的ORF，编码数量不等的群特异性辅助蛋白（Accessory protein）。这些辅助蛋白在不同冠状病毒中的编码区位置以及个数差异都比较大，主要发挥免疫调节功能。在PDCoV的M基因和N基因之间以及N基因内部分别存在一个ORF，分别编码辅助蛋白NS6和NS7，但具体功能尚不清楚。另外，PDCoV的每个编码基因都有一致的转录调控序列（TRS），5'-ACACCA-3'与其它冠状病毒相比，该序列是δ冠状病毒属成员独有的。N基因下游和3'端poly（A）尾上游还存在茎环结构，保守的RNA元件，具体功能还不清楚[3]。

2 猪德尔塔冠状病毒的流行

研究人员早在2012年就从临床样品中检测到了PDCoV，但并没有分离到病毒，也没有对该病毒进行大规模的流行病学调查。2014年1—2月，美国暴发仔猪腹泻期间，研究人员从俄亥俄州、爱荷华州、伊利诺斯州发生腹泻的猪场检测到了PDCoV，而且这些猪场的猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus,TGEV）、猪轮状病毒（Porcine rotavirus,PoRV）等几种常见的引起腹泻的病毒均为阴性，这显示PDCoV具有较强的致病性。全基因组序列分析发现，与2012年香港检测到的两株PDCoV（HUK15-44和HUK15-155）同源性高达99%[4]。随后，研究人员在美国的明尼苏达、南达科他等9个州均检测到PDCoV感染。目前，美国有19个州发生δ冠状病毒感染，这表明PDCoV在美国普遍流行。2014年4月，在韩国、加拿大发生腹泻的仔猪粪便中也检测到PDCoV，与美国分离株同源性达99.7%以上[5]。

国内研究人员董楠等对2013—2014年间采自湖北、江苏、广东、河南、安徽等省市规模化猪场的258份粪便样品进行检测，共检测到21份阳性样品，阳性率为14.3%，这是首次证实在我国猪场中存在PDCoV[6]。研究人员对检测的部分阳性样品进行全基因组分析发现，我国大陆猪场中的PDCoV与2012年香港检测到的PDCoV HUK15-155株具有较高的同源性。此外，国内学者Song等采用建立的巢式RT-PCR检测了2012—2015年期间从江西省采集的356份临床样品，结果显示PDCoV的阳性率高达33.71%[7]。迄今为止，GenBank中共收录了25条来源于美国、中国、韩国的PDCoV全基因组序列，进化系统树分析显示这些毒株的同源性很高，遗传进化关系很近，可能起源于同一毒株。

为了搞清楚PDCoV是何时传入美国的，研究人员对2014年美国18个州51个猪场的血清样品进行PDCoV抗体检测，结果表明样品阳性率为8.7%，猪场阳性率为25.5%。研究人员同时也从2010年的血清样品中检测到相应的抗体，表明PDCoV可能早在2010年就在美国猪场中存在。还有研究人员采用Real Time RT-PCR方法对2012—2013年间采自美国猪场的1 734份临床样品进行检测，结果发现来源于明尼苏达州、爱荷华州以及伊利诺斯州2013年的部分样品为PDCoV阳性，这也表明PDCoV至少在2013年就存在于美国猪群中。国内的一个实验室对其保存的临床样品进行了RT-PCR检测发现，2004年的2份临床样品为PDCoV阳性，这提示11年前PDCoV可能就在中国大陆存在，而且基因组序列与2012年中国香港检测到的HUK15-44具有很高的同源性[6]。

3 猪德尔塔冠状病毒的致病性

在临床上，PDCoV可感染各个年龄阶段的猪，不过主要引起新生仔猪腹泻。在试验条件下，为了避免肠道细菌的协同致病作用，用过滤的PDCoV阳性病料人工感染10日龄无菌仔猪，感染后21小时左右出现明显的临床症状，主要表现为粥样腹泻，48小时和72小时出现呕吐，96～120小时出现严重脱水、体重减轻、昏睡症状。用PDCoV感染细胞的培养物分别人工感染10日龄无菌仔猪和普通仔猪，都能引起严重的腹泻。对于普通仔猪，腹泻症状可持续7～10天，体重减轻，随后症状缓解，体重逐渐增加，在整个过程中体温变化不明显。值得注意的是，人工感染普通仔猪引起的腹泻症状较无菌仔猪严重，时间更早，病毒在普通仔猪体内存在时间至少可达21天，这说明肠道细菌可能在PDCoV的致病中发挥着协同作用[8]。

4 猪德尔塔冠状病毒的诊断

PDCoV与PEDV、TGEV等其它猪肠道冠状病毒感染引起的临床症状非常相似并且存在混合感染。因此，对PDCoV的诊断主要依靠实验室检测。目前，已经建立的PDCoV检测方法包括病原学检测和抗体检测。病原学检测技术主要有普通RT-PCR、巢式RT-PCR、荧光定量RT-PCR、免疫组织化学分析等。因为PDCoV的M基因高度保守，大部分的RTPCR检测技术都是针对该基因。有学者采用PDCoV编码蛋白M、N、S的多肽免疫家兔，并利用免疫兔的血清作为一抗，建立了PDCoV免疫组织化学（ICH）方法。采用该方法分析了PDCoV感染猪的不同组织，结果显示PDCoV阳性信号主要集中在空肠中端、末端以及回肠部分，表明病毒对空肠中末端及回肠最敏感，为PDCoV的临床诊断、组织分布以及致病机理研究奠定了基础[8]。

在抗体检测技术方面，有学者采用体外表达纯化的S1蛋白作为包被抗原，建立了检测PDCoV抗体的间接ELISA（酶联免疫吸附试验）方法，这种方法的敏感性为91%，特异性为95%。对355份血清样品进行检测，结果阳性率为8.7%[9]。上述抗原和抗体检测方法的建立，为PDCoV的病原学和流行病学调查提供了重要工具。

5 猪德尔塔冠状病毒的防控

目前，尚无针对PDCoV的商品化疫苗与诊断试剂。相信随着研究的深入，尤其是对其致病和免疫机理的深入了解，在不久的将来，PDCoV的疫苗和诊断试剂都会相继面世，用于控制该病的发生与流行。

粪-口传播和通过污染病毒的器械设备等非生物媒介传播是PDCoV在猪群内和猪群间传播病毒的主要途径。采食含有PDCoV污染的饲料和饲料原料是病毒传播的一个风险因素。美国明尼苏达大学的研究人员调查了PDCoV在饲料和饲料原料以及环境（新鲜粪便和粪浆）中的存活情况。结果显示，在25℃环境下，饲料原料储存的时间在21天以上才能够减少病毒存活，而且不能够保证病毒的完全灭活。病毒在不同饲料原料中的存活有差异，其中在预混饲料和肉骨粉中病毒的存活率最高。在粪便和粪浆中，越高的温度下病毒灭活越多。因此，将样品暴露于更高的温度中，并延长储存时间能够灭活PDCoV，降低传播的潜力。因此，做好养猪场的清洁消毒工作，加强饲料管理仍然是做好PDCoV预防工作的重要内容。

[1]Jonassen C M,Kofstad T,Larsen I L,et al.Molecular identification and characterization of novel coronaviruses infecting graylag geese,feral pigeons[J].J Gen Virol,2005,86(6):1597-1607.

[2]Dong B Q,Liu W,Fan X H,et al.Detection of a novel and highly divergent coronavirus from Asian leopard cats and Chinese ferret badgers in southern China[J].J Virol,2007,81(13): 6920-6926.

[3]Woo P C Y,Huang Y,Lau S,et al.Coronavirus Genomics and Bioinformatics Analysis[J].Viruses-Basel,2010,2(8):1804-1820.

[4]Marthaler D,Jiang Y,Collins J,et al.Complete genome sequence of Strain SDCV/USA/Illinois121/2014,a porcine Deltacoronavirus from the United States[J].Genome Announce,2014, 2(2):1-23.

[5]Lee S,Lee C.Complete Genome Characterzation of Korean Porcine DeltacoronavirusStrainKOR/KNU14-04/2014[J]. Genome Announce,2014,2(6):23-28.

[6]Dong N,Fang L R,Zeng S L,et al.Porcine Deltacoronavirus in Mainland China[J].Emerg Infect Dis,2015,21(12):2254-2255.

[7]Song D,Zhou X,Peng Q,et al.Newly Emerged Porcine Deltacoronavirus Associated with Diarrhoea in Swine in China:I－dentification,Prevalence and full length Genome sequence analysis[J].Transbound Emerg Dis,2015,62(6):575-580.

[8]Ma Y M,Zhang Y,Liang X Y,et al.Evolution and Virulence of Porcine Deltacoronavirus in the United States[J].Mbio,2015,6(2): 116-234.

[9]Thachil A,Gerber P F,Xiao C T,et al.Development and application of an ELISA for the detection of porcine deltacoronavirus IgG antibodies[J/OL].Plos one,2015,10(4): e0124363.

（编辑：柳青）

S858.285.3

A

1002-1957(2016)05-0115-03

2016-07-22

翁善钢（1985-），男，江苏常熟人，硕士，主要从事各类动物疫病流行病学及其防控对策研究.E-mail：sgweng@163.com