猪流行性腹泻病毒分子生物学检测方法研究进展

2016-03-27李天芝于新友梅建国李峰沈志强

养猪 2016年5期

关键词：流行性毒株定量

李天芝，于新友，梅建国，李峰，沈志强

（1.山东绿都生物科技有限公司，山东滨州256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州256600）

猪流行性腹泻病毒分子生物学检测方法研究进展

李天芝1，于新友1，梅建国2，李峰2，沈志强2

（1.山东绿都生物科技有限公司，山东滨州256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州256600）

文章综述了猪流行性腹泻病毒分子生物学检测方法，主要包括核酸探针、常规PCR方法、套式PCR方法、多重PCR方法、荧光定量PCR方法、环介导等温扩增等6种方法，对猪流行性腹泻防控有一定的参考价值。

猪流行性腹泻病毒；分子生物学；检测方法

猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）可感染猪导致猪流行性腹泻，该病的主要特征是猪呕吐、脱水和水样腹泻，是一种高度接触性肠道传染病，多发生于冬、春季节，但夏季也可发病。该病最初发生在英国，随后世界各地均有相关报道，我国于1976年最初报道该病。各日龄的猪均可感染PEDV发病，其中哺乳仔猪受到的危害最严重，给养猪业造成了巨大的经济损失。分子生物学检测方法以检测速度快、灵敏度高、特异性好等特点已经广泛应用于细菌和病毒病的检测，并展示良好的应用前景。笔者就目前国内外PEDV检测的分子生物学方法的最新研究进展进行综述，为猪流行性腹泻的诊断和防控提供参考。

1 核酸探针

核酸探针又称核酸杂交，利用核苷酸碱基顺序互补的原理，用特异的基因探针即识别特异碱基序列（靶序列）的有标记的一段单链DNA（或RNA）分子，与被测定的靶序列互补，以检测被测靶序列的技术。Kim等[1]将标记地高辛的核酸探针（0.1 ng/μL）加入300 μL的标准杂交缓冲液中，95℃加热10 min后，在冰上淬火，标记地高辛的核酸探针可以与人工感染仔猪的PEDV的核衣壳蛋白基因进行碱基互补配对，通过透射电镜下观察到仔猪的空肠和结肠的上皮细胞的胞质呈黑色，从而可以证明是PEDV感染的仔猪腹泻，该试验在79个阳性样本中检测出71个是阳性的，检出率为89.87%。

2 常规PCR方法

PCR方法是根据目的片段设计引物，借助仪器和DNA聚合酶体外大量扩增部分或全部目的片段，是一种快速、简便、特异的诊断方法。陈宏智等[2]建立了检测PEDV的RT-PCR检测方法，结果显示，该法对猪瘟病毒（CSFV）、大肠杆菌、伪狂犬病病毒（PRV）、猪圆环病毒2型（PCV2）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）均为阴性，具有特异性。该法最低可检测到2.3×10-3μg/μL的PEDV RNA，将建立的方法与商品试剂盒相比较，分别对126份临床疑似PEDV感染的病料进行检测，结果显示，二者的符合率为100%。于新友等[3]建立了检测猪流行性腹泻病毒一步法RT-PCR方法，并对其特异性、敏感性进行了研究。结果显示，该法对猪流行性腹泻病毒（PEDV）扩增结果为阳性，对照毒株扩增结果均为阴性，对猪流行性腹泻病毒检测的灵敏性为100 pg总RNA量。李长龙等[4]在PEDV ORF3基因缺失区域两端设计合成引物，建立了可对PEDV野毒株和疫苗株进行鉴别诊断RT-PCR方法，野毒株扩增产物为319 bp，疫苗株扩增产物为270 bp，用该鉴别诊断方法对猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的cDNA进行扩增均无特异性条带，说明该方法特异性强。秦毅斌等[5]建立了检测PEDV变异毒株的RTPCR方法结果显示，建立的RT-PCR鉴别检测方法能特异性区分疫苗株CV777和PEDV变异毒株，仅能扩增出PEDV变异毒株826 bp的目的片段，与猪传染性胃肠炎病毒、A群猪轮状病毒、猪嵴病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪瘟病毒及猪细小病毒均无交叉反应。敏感性试验结果显示，该方法能检测到的最低核酸质量为11.3 pg。

3 套式PCR方法

套式PCR方法是设计内、外2对引物，通过2次扩增对样品检测，该法能节省时间和试剂用量，且敏感性较高。王金良等[6]根据已发表的PEDV N基因核苷酸序列，设计合成2对引物，建立了检测PEDV的套式RT-PCR方法，其中外引物扩增片段长度为297 bp，内引物扩增片段长度为212 bp。邓祖丽颖等[7]根据GenBank中PEDV基因组序列，设计并合成针对M基因的内、外2对特异性引物，通过优化反应条件，建立了检测PEDV的巢式RT-PCR方法。结果显示，该法对猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪瘟病毒的扩增结果均为阴性。当使用外引物或内引物进行常规RT-PCR时检测限量均为50 pg PEDV RNA模板，而使用巢式RT-PCR可检测到50 fg PEDV RNA。刘琪等[8]根据GenBank中猪流行性腹泻病毒（PEDV）的基因序列分别设计两对引物，在完成最佳条件筛选、特异性、敏感性试验的基础上，建立一种快速区分PEDV疫苗毒株与野毒株的巢式PCR检测方法。建立的PCR快速检测方法能分别对PEDV疫苗毒株和野毒株扩增出特异性片段，片段大小分别为774 bp和150 bp。该方法对TGEV、轮状病毒（RV）、CSFV、PRV则不能扩增出特异性片段。

4 多重PCR方法

多重PCR是在常规PCR基础上发展起来的，在同一PCR体系中，加入多对引物，同时检测2种或多种病原核酸，它具有快速、灵敏度高、特异性强等优点广泛用于各种临床疾病的快速诊断。吴洋等[9]建立了可同时检测PEDV、TGEV、RV的多重RTPCR方法，结果显示，该方法可以同时扩增PEDV（682 bp）、TGEV（480 bp）和RV（297 bp）的特异性DNA片段，而对猪瘟病毒和猪伪狂犬病病毒的PCR扩增结果均为阴性，敏感性试验结果表明，该多重RT-PCR方法对PEDV、TGEV和RV的最低检出量分别为3.3×103拷贝/μL、3.2×103拷贝/μL、2.8×103拷贝/μL。贾锐等[10]根据GenBank中已登录的TGEV、PEDV的序列，利用Primer 5.0计合成了2对特异性引物。用这2对引物对TGEV、PEDV cDNA模板首先进行单项PCR条件优化，然后采用正交试验设计优化多重RT-PCR反应条件，结果同时扩增到2条与试验设计相符的492 bp（PEDV）和211 bp（TGEV）特异性条带，建立了能够同时检测2种病毒混合感染的特异、灵敏的多重PCR检测方法，可检测出约11 pg的PEDV和13 pg的TGEV。谭飞等[11]根据Gen－Bank中发表的CSFV和PEDV的基因组序列，设计筛选出两对用于双重RT-PCR反应的特异性引物，通过对特异性、灵敏性和稳定性等试验，建立了检测猪流行性腹泻病毒和猪瘟病毒的双重RT-PCR核酸检测技术。利用建立的CSFV-PEDV双重RTPCR核酸检测技术，对某规模化猪场病料进行检测，结果表明，扩增出约311 bp和501 bp大小的特异性条带，为猪瘟与猪流行性腹泻病毒混合感染。于新友等[12]根椐GenBank中登录的PEDV、TGEV和猪A群轮状病毒（PARV）基因序列，分别设计3对引物，在建立各病毒单项一步法RT-PCR技术的基础上，优化多重RT-PCR反应条件，建立了3种病毒的一步法多重RT-PCR检测方法，用这3对引物对同一样品中的PEDV、TGEV和PARV核酸模板进行多重RT-PCR扩增，结果可同时扩增PEDV的450 bp、TGEV的609 bp、PARV的241 bp特异性片段，而对其它4种病原的扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明，该多重RT-PCR技术能检出10pg的PEDV、10pg的TGEV和1 pg的PARV模板。任玉鹏等[13]根据GenBank中PEDV和TGEV基因序列保守区设计2对引物，参照文献合成1对猪Delta冠状病毒（PDCoV）引物，优化3对引物在同一RT-PCR扩增体系下的浓度、退火温度等反应条件，同时优化方法的灵敏度、特异性。结果表明，建立的多重RT-PCR在引物量分别为PEDV 0.2 L，PDCoV 0.2 L和TGEV 0.4 L，退火温度为53℃时的扩增效果最佳，最低检测量分别为PEDV：60.96 pg、PDCoV：58.85 pg、TGEV：102.69 pg，用该法对多种猪传染病病原DNA或cDNA进行扩增时均无非特异性扩增条带出现。朱海侠等[14]根据GenBank中PED疫苗株与野毒株ORF3的特点设计特异性引物，建立能够快速区分PEDV疫苗株与野毒株的RT-PCR检测方法。建立的RT-PCR检测方法能够对PEDV疫苗株与野毒株扩增出特异性片段，其大小分别为278 bp和327 bp。该方法具有快速、特异、通用等特点，可用于实验室快速诊断、野毒株的区分，为该病的诊断及免疫防控提供参考依据。

5 荧光定量PCR方法

荧光定量PCR技术是指采用荧光探针或SYBR GreenⅠ荧光染料通过连续监测荧光信号强弱的变化来测定特异性产物的量，不需要分离PCR产物，即能准确定量起始模板数。且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等优点。沈学怀等[15]建立了PEDV的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR检测方法，该法在1.21× 103～1.21×108拷贝/μL范围内呈现良好的线性，相关系数R2为0.999，扩增效率为99%，扩增产物的熔解曲线为单个特异峰，产物Tm值为85.5～86℃，最低检测限为1.21×101拷贝/μL。张志等[16]根据猪流行性腹泻病毒N基因序列设计合成引物和探针，通过对荧光定量RT-PCR反应条件的优化，建立了TaqMan荧光定量RT-PCR检测PEDV的方法。结果显示，该方法的标准曲线的相关系数为0.99，检测敏感性达到26.1拷贝/μL，且具有很好的特异性和重复性，对猪瘟病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等检测结果均为阴性，批内和批间变异系数均小于2.5%。董世娟等[17]建立检测PEDV的TaqMan荧光定量PCR方法，并验证其敏感性、特异性及重复性。结果表明：建立的定量标准曲线Ct值和模板起始拷贝数对数在108~11拷贝/μL有良好的线性关系，相关系数R2为0.997，该方法可检测到初始模板中6.368拷贝/pL的质粒DNA，应用该方法检测49份临床样品，阳性率达98%，比普通RT-PCR方法检测的阳性率高18%。于长青等[18]用RT-PCR方法扩增PEDV的M基因片段，并克隆到PUC-T载体中，构建含有PEDV M基因片段的重组质粒。以系列稀释后的重组质粒为模板，基于SYBR GreenⅠ进行PEDV检测的实时荧光定量PCR扩增。结果显示，扩增效率为100.4%，相邻扩增曲线之间间距均匀，所有产物的熔解曲线具有单一整齐的峰，标准曲线具有优良的线性关系，最低可准确检测520拷贝/μL的核酸模板，重复性试验的变异系数小于3%。用所建立方法对3种常见猪源RNA病毒的检测结果均为阴性，对临床样品的检出率显著（P< 0.05）高于常规PCR方法。曹贝贝等[19]根据GenBank中登录的PEDV ZKHFQ株的N基因序列的保守区设计1对特异性引物，经过对反应条件进行优化，建立了检测PEDV的SYBR GreenⅠ荧光定量RTPCR方法。该方法对常见的病毒均未检测到荧光信号，而仅对PEDV检测为阳性，其灵敏度为57拷贝/μL，组内和组间变异系数均小于1%。利用该方法对26份疑似PEDV感染的病料样品进行检测，结果显示本研究所建立的方法对PED的检出率比常规PCR高23.07%。劳秀杰等[20]根据GenBank报道的N基因高度保守核苷酸序列，设计并合成1对引物。上下游引物与GenBank中登录的153株PEDV N基因全长序列匹配度分别是100%和97%。以本实验室分离流行毒株为模板，利用SYBR GreenⅠ荧光染料法进行RT-PCR扩增，获得扩增产物构建重组质粒作为阳性对照，建立检测猪流行性腹泻病毒核酸的方法。同一样品进行3次重复试验，变异系数<0.9%。通过对临床样品进行检测和测序验证，核酸检测结果中的阳性样品准确率为100%。

6 环介导等温扩增技术

环介导恒温扩增检测方法（LAMP）是一种新兴的分子生物学检测方法，已广泛应用于多种细菌病和病毒病的检测。以操作简单、检测速度快、敏感性高、特异性好等优势适合基层部门应用。郑新添等[21]针对PEDV的NP基因设计LAMP引物，对反应体系优化并进行特异性及敏感性等试验，建立了PEDV LAMP检测方法，结果表明，该方法在65℃下恒温扩增60 min，经SYBR GreenⅠ染色后仅肉眼观察即可判定结果。该方法特异性好，与传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒及大肠杆菌等无交叉反应，对重组质粒最低检测限度为16拷贝/μL。Yu等[22]建立了可视化检测PEDV的RT-LAMP方法，该方法在62℃水浴条件下，45 min即可完成试验反应，结果显示，该法特异性好，对常见猪病毒的扩增结果均为阴性，其敏感性是一步法RT-PCR的100倍。Gou等[23]建立了PEDV的LAMP检测方法，该方法在62℃水浴条件下，40 min即可完成反应，结果显示，该法最低可检测10 pg的RNA量，该法特异性好对常见猪病毒的扩增结果均为阴性，且不与其它常见猪病毒核酸发生交叉反应，特异性较好。时建立等[24]根据PEDV S基因设计特异性引物，通过优化各种反应条件，建立了检测PEDV的LAMP快速检测方法。此方法敏感度强，将反转录后的病毒cDNA稀释到108倍仍可检出，是PCR方法的100倍，该法特异性好，对其它病原的扩增结果均为阴性。

7 小结与展望

随着分子生物学的发展，各国专家、学者先后建立了多种PEDV分子生物学检测方法，但这些方法各有优缺点，如常规PCR方法、套式PCR方法和多重PCR方法虽然检测简单、快速、方便但不能精确定量，且敏感性有限，容易漏检。荧光定量PCR技术弥补了常规PCR方法的缺点，但由于所用仪器和试剂价格昂贵，成本高，且对操作人员有很高的要求，不利于其在基层兽医部门大规模推广应用。LAMP方法是一种新兴的方法，不需要特殊的仪器设备，操作简便，更适合基层应用。单独使用任何一种方法都很难正确诊断该病，做好将各种方法结合起来，综合判断，不同单位可根据自身的情况选择适合的方法，相信随着分子生物学的不断发展，将会有更多的新型分子生物学诊断方法建立，从而为猪流行性腹泻的诊断、分子流行病学调查和防控提供保障。

[1]Kim O,Chae C.Comparison of reverse transcription polymerase chain reaction,immunohistochemistry,and in situ hybridization for the detection of porcine epidemic diarrhea virus in pigs[J].Can J Vet Res,2002,66(2):112-116.

[2]陈宏智，曲哲会，易本驰，等.猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立及初步应用[J].畜牧与兽医，2014，46（7）：99-101.

[3]于新友，李天芝，王金良，等.一步法RT-PCR快速检测猪流行性腹泻病毒[J].养猪，2014（5）：118-120.

[4]李长龙，陈建飞，张鑫，等.猪流行性腹泻病毒野毒株/疫苗株RTPCR鉴别诊断方法的建立[J].中国兽医杂志，2014，50（6）：6-8.

[5]秦毅斌，卢冰霞，赵武，等.猪流行性腹泻病毒变异毒株与经典毒株RT-PCR鉴别检测方法的建立及应用[J].中国兽医科学，2014，44（5）：509-514.

[6]王金良，谢金文，唐娜，等.应用逆转录套式PCR检测猪流行性腹泻病毒[J].中国畜牧兽医，2012，39（9）：86-88.

[7]邓祖丽颖，陈陆.猪流行性腹泻病毒巢式RT-PCR检测方法的建立及应用[J].中国畜牧兽医，2014，41（1）：34-37.

[8]刘琪，冯晓声，周如月，等.鉴别猪流行性腹泻疫苗毒株与野毒株巢式PCR检测方法的建立及初步应用[J].广东畜牧兽医科技，2015，40（2）：36-38.

[9]吴洋，杜彩虹，张博，等.猪腹泻相关病毒多重RT-PCR检测方法的建立[J].中国预防兽医学报，2014，36（5）：376-378.

[10]贾锐，叶佳欣，俞向前，等.猪传染性胃肠炎及流行性腹泻病毒二重RT-PCR检测方法的建立[J].上海交通大学学报（农业科学版），2014，32（4）：71-75.

[11]谭飞，马士博，王瑞翀，等.猪瘟病毒和猪流行性腹泻病毒双重RT-PCR方法的建立[J].中国兽医杂志，2015，51（10）：28-30.

[12]于新友，李天芝，沈志强.一步法多重RT-PCR检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪A群轮状病毒方法的建立和应用[J].养猪，2016（2）：105-108.

[13]任玉鹏，张斌，汤承，等.同时检测PEDV和TGEV及PDCoV的多重RT-PCR方法的建立及初步应用[J].中国兽医科学，2016，46（6）：756-762.

[14]朱海侠，曾亮明，傅星源，等.猪流行性腹泻病毒疫苗株与野毒株RT-PCR检测方法的建立与应用[J].福建畜牧兽医，2016，38（3）：14-16.

[15]沈学怀，潘孝成，巩雅静，等.猪流行性腹泻病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用[J].养猪，2014（6）：109-112.

[16]张志，刘自立，董雅琴，等.猪流行性腹泻病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J].中国动物检疫，2014，31（4）：76-84.

[17]董世娟，石明明，朱于敏，等.猪流行性腹泻病毒荧光定量PCR检测方法的建立及应用[J].上海农业学报，2015，31（1）：11-16.

[18]于长青，林树伯，刘乐荣，等.猪流行性腹泻病毒荧光定量PCR检测方法的建立与应用[J].北京农学院学报，2015，30（3）：44-47.

[19]曹贝贝，韩丽，于朋飞，等.猪流行性腹泻病毒SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J].中国预防兽医学报，2015，37（6）：461-464.

[20]劳秀杰，王静静，郑东霞，等.猪流行性腹泻病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J].中国动物检疫，2016，33（1）：62-66.

[21]郑新添，黄其春，黄翠琴，等.环介导等温扩增技术快速检测猪流行性腹泻病毒[J].中国预防兽医学报，2014，36（10）：780-783.

[22]Yu X,Shi L,Lv X,et al.Development of a real-time reverse transcription loop-mediated isothermal amplification method for the rapid detection of porcine epidemic diarrhea virus[J]. Virol J,2015,12:76.

[23]Gou H,Deng J,Wang J,et al.Rapid and sensitive detection of porcine epidemic diarrhea virus by reverse transcription loopmediated isothermal amplification combined with a vertical flow visualization strip[J].Mol Cell Probes,2015,29(1):48-53.

[24]时建立，彭喆，王莉莉，等.猪流行性腹泻病毒LAMP检测方法的建立及初步应用[J].中国动物检疫，2016，33（7）：82-85，89.

（编辑：郭玉翠）

延缓衰老跑步最好

【德国《世界报》网站8月17日报道】题：这样训练最能保持年轻

端粒像保护罩一样位于染色体的末端。随着年龄增长，端粒变得越来越短并在某个时刻完全消失。这时染色体粘在一起，细胞死亡。专家称，人们可以对这一过程多少施加些影响。

德国萨尔兰大学医学中心的心脏专科医生克里斯蒂安·维尔纳及其同事对哪种运动最有助于防止细胞老化进行了研究。他们将200多名年龄在30至60岁、从不做运动但也不吸烟、没有血压或心脏问题的成年人分成四组，其中三组分别进行耐力训练、间歇运动训练与力量训练。另外一组则保持不运动的状态，以便进行比较。

结果发现，三种训练都达到了稳定端粒的效果，所有从事运动的人的端粒数量都多于不运动的人。但是只有跑步激活了端粒酶。这种酶存在于人体细胞内，并负责生成端粒。维尔纳说，不管参加者是进行了间歇跑训练还是绕着跑道跑圈，端粒酶在细胞内的活动都增加至两倍。这不仅对端粒有益，总体来说也对细胞有好处。

他说：“适度和定期的耐力训练能遏制血管细胞的老化并降低患心血管疾病的风险。训练令心脏和血管的抗压能力提高。”

虽然人们无法将心脏训练得更年轻，却可以令其保持年轻。因此在50岁时开始跑步也是值得的。“在最理想的情况下，到80岁时你还可以拥有50多岁的人的心脏。”

对力量训练爱好者来说也有令人欣慰的消息：器械训练也强化了端粒，只不过是以另外的方式，而且效果没有跑步好。

美国近期的一项研究显示，力量训练也能延长寿命。宾夕法尼亚州立大学的珍妮佛·克瓦什涅夫斯基，将针对退休人员进行的一次大规模健康调查的数据与死亡登记的数据进行了比较。

有3万多名65岁以上的人接受了调查，回答的问题包括他们是否像医生建议的那样进行了肌肉训练，因为这可以预防骨折和其他老年问题。调查显示，其中9%的老年人每周进行两次力量训练。