猪圆环病毒2型的免疫学和病毒进化

2016-03-27翁善钢

养猪 2016年5期

关键词：病原体猪只猪群

翁善钢

（外高桥出入境检验检疫局，上海浦东新区200137）

猪圆环病毒2型的免疫学和病毒进化

翁善钢

（外高桥出入境检验检疫局，上海浦东新区200137）

猪圆环病毒2型相关性系统疾病（Porcine circovirus 2-systemic disease,PCV2-SD）曾被称为断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS），这种疾病造成猪只死亡率增加，生长变缓，对猪场造成严重的经济损失。PCV2-SD的临床症状包括消瘦、日增重降低、贫血、腹泻、呼吸困难等。由于感染病毒猪只的B和T淋巴细胞耗竭，淋巴组织内可以观察到广泛的病变。血液和淋巴器官中B和T细胞的数量减少，与此同时，巨噬细胞/单核细胞的数量增加。目前的研究认为，PCV2是引起PCV2-SD或者其它猪圆环病毒病（Porcine circovirus diseases,PCVD）的一种必要而不充分的病原体。因为，PCV2在世界各地的猪场广泛存在，但仅有一部分猪只会出现上述疾病，也就是说大部分猪只属于PCV2亚临床感染。

自2007年以来，一系列商业疫苗在猪场的使用显著降低了PCV2感染引起的损失。尽管已有有效的疫苗，但PCV2仍然在不少猪群甚至是免疫猪群中流行传播。PCV2具有一个环状的单链DNA基因组，长度仅为1.7 kb。复制相关蛋白（Rep和Rep'）由ORF1编码，衣壳蛋白（Cap）由ORF2编码，ORF3和ORF4分别编码参与细胞凋亡和抗细胞凋亡的蛋白。衣壳基因（cap）常被用于基因的系统发生学研究。根据系统发生学研究或PCV2的完整基因序列，目前PCV2被分成4种基因型，分别是PCV2a、PCV2b、PCV2c和PCV2d。PCV2具有较高的突变率，最近的研究称疫苗的使用对PCV2的进化也产生了重要影响[1]。

在理想的条件下，对病原体的免疫应答导致病原体被清除或产生免疫记忆。与此相反，病原体在进化过程中采取的策略是规避和利用免疫系统来完成其生命周期。有些病原体，如PCV2，能够在宿主长期存在，引起延长的促炎症状态，产生免疫病理作用。不同猪只感染PCV2后的结果有所不同。一些猪能够产生足够的体液和细胞免疫清除感染。不过，受到PCV2-SD影响的猪会出现严重的淋巴细胞耗竭。研究人员认为这是PCV2引起免疫抑制的主要原因。

1 PCV2的免疫调节能力

先天性的非适应性宿主免疫应答是应对病原体感染的早期屏障。这种反应在一种新的病原体入侵后立即激活。如果早期反应并不能清除病原体，适应性免疫应答就发生了。在对病原体防御的过程中，树突细胞（dendritic cells,DC）起着重要作用。树突细胞与巨噬细胞是最早遇到病原体的细胞，它们吞噬、消化病原体，将抗原呈递给T淋巴细胞，引发适应性免疫。主要有两种类型的树突状细胞：常规的树突状细胞（conventional DC,cDC）和浆细胞样树突状细胞（plasmacytoid DC,pDC）。cDC的主要作用是抗原呈递，pDC能生产Ⅰ型干扰素（interferon,IFN）。与其它病毒相似，PCV2能够调节DC的活动。PCV2能够被DC吞噬，但并不能够在这些细胞中复制，也不会影响到这些细胞的生存。cDC的功能不会因为PCV2增加而受到损害，pDC的功能会受到病毒影响。在许多病毒感染的过程中，IFN-α通常是pDC诱导产生的。IFN-α的作用是诱导抗病毒状态的出现。然而，PCV2对体外培养的pDC/单核细胞诱导产生IFN-α具有下调作用。与此相反，在体内，PCV2感染显示出具有诱导IFN-α分泌的作用。这说明PCV2具有免疫刺激和抑制的双重作用。具体来说，病毒的基因组或者部分基因组能够调节细胞因子的反应，这可能是通过抑制/刺激CpG基序与细胞中的胞质或胞内受体相互作用进行的[2]。

表达PCV2感染另一个关键的细胞因子是多效性细胞因子IL-10。先天性细胞（巨噬细胞、DC）和适应性细胞（B细胞和CD4+和CD8+细胞的亚群）都可以产生IL-10。IL-10能够抑制参与清除病原体的细胞，如巨噬细胞、Th1和NK（自然杀伤）细胞。关于IL-10在PCV2感染期间的重要性已有不少体内和体外研究。体外培养的PBMC，特别是单核细胞/DC/巨噬细胞群，IL-10的表达由PCV2诱导，非致病性PCV1并不能诱导表达IL-10。PCV2感染PBMC释放出的IL-10能够抑制IFN-γ、IFN-α和IL-12的产生[3]。单核细胞/DC/巨噬细胞被认为与IL-10的产生有关。这些细胞中IL-10的诱导可能的通路是通过Toll样受体9（Toll-like receptor 9,TLR9）。TLR9是一种核内表达的受体，能够识别未甲基化的DNA。患PCV2-SD的猪的胸腺中IL-10的转录也有所增加，这通常还跟胸腺萎缩有关。由PCV2诱导产生的IL-10是引起患PCV2-SD的猪免疫紊乱的重要细胞因子。此外，全身性的IL-10水平与感染21天后血液中的病毒载量有关[4]。

2 针对PCV2的细胞和体液免疫反应

从胎儿到成年动物，针对PCV2感染的体液免疫应答都已有研究。PCV2在母猪子宫内感染会导致胎儿抗体的产生。子宫内的胎儿感染病毒后会增加针对PCV2的体液免疫应答。母源抗体可以通过胎盘进入胎儿，这些抗体可以在胎儿检测到。事实上，母猪抗PCV2抗体的滴度越高，仔猪中检测到抗体的可能性越大[5]。

仔猪出生后能够获得源自初乳中母源中和抗体的保护。而到了哺乳和保育期，这些主动获得抗体的量会下降。母源抗体的减弱使得猪只在主动的血清转换之后对PCV2感染更为易感。中和抗体在清除病毒方面是有效的。中和抗体不足与PCV2复制增加、严重的淋巴病变和形成PCV2-SD有关。有趣的是，在感染期间，抗体不仅针对Cap蛋白也针对非结构性的Rep蛋白。无论是健康的猪只，还是患PCV2-SD的猪只，抗cap的抗体比抗rep的抗体产生要早，滴度也要高。

最近也有不少报道研究了细胞免疫。这主要是因为PCV2抗体并不能够提供充分的保护。细胞免疫，特别是IFN-γ分泌细胞（SC）的产生与PCV2在血清中的病毒载量呈负相关。在记忆抗原的刺激下，特异性IFN-γSC和T细胞能够产生IFN-γ。研究显示PCV2感染和疫苗接种后，细胞介导的免疫能够增加。有趣的是，IFN-γSC对非结构Rep和结构Cap蛋白都具有特异性。PCV2-SD病猪出现B和T淋巴细胞减少是由PCV2感染引起的。值得注意的是，由B细胞和CD3+CD4+CD8+细胞来记忆/活化的Th淋巴细胞会被耗竭。细胞耗竭与形成PCV2-SD有关。疫苗接种和病毒感染都能引起记忆/活化Th细胞。这些细胞是抗原特异性的T细胞和记忆细胞。病毒感染或疫苗接种之后，抗原特异性记忆T细胞能够长期存在，能够在唤起抗原识别之后快速扩展。因此，这样可以快速防止PCV2感染。更具体地说，PCV2特异性IFN-γ/TNF-α和共同产生的CD4+细胞在疫苗免疫或病毒感染之后，在控制和清除PCV2感染方面起着重要作用。有趣的是，这些细胞亚群能够被所有的免疫/感染的猪只诱导产生，而特异性的抗体仅能在45%的猪只中检测到。这些报道进一步强调了细胞免疫在感染动物中控制和清除PCV2的重要性[6]。

3 PCV2的进化

在过去的20年中，PCV2是最重要的猪病原体之一。目前，PCV2疫苗已广泛用于商业化猪场。由于疫苗不能够诱导杀菌免疫，因此即使接种了疫苗，病毒仍然可能在猪群中传播。PCV2在免疫猪群中传播的复制率（reproduction ratio,R0）为1.5，而在非免疫猪群中R0为5.2。R0测定的是感染期间，1头猪造成的继发感染的平均数量。因此，R0＞1则意味着病原体将维持在猪群中。由此可见，PCV2疫苗能够有效降低感染压力，但并不能够将病毒清除出猪场[7]。

PCV2疫苗是基于Cap蛋白或完整病毒的。在系统发育分析研究中，cap基因用于将PCV2毒株分成4个基因型。目前，用于将PCV2分成不同基因型的遗传距离＞3.5%。在2000年之前，PCV2a一直是最常见的基因型。不过，如今PCV2b已经取代PCV2a成为PCV2-SD暴发时最常见的基因型。PCV2c最早在丹麦被发现，发生的频率较低。PCV2d是近几年新出现的一种基因型，还在继续进化中。不同基因型之间的全基因组差异在8%～12%之间。PCV2c的差异最大，PCV2d次之。不同基因型的衣壳蛋白的氨基酸序列差异在6%～15%之间。

PCV2的差异性是以1.2×10-3（替换/位点/年，substitution/site/year）的高进化速率产生的。作用于变异毒株的选择作用会进一步塑造PCV2的进化。事实上，由于cap基因的突变，新的抗原的变异毒株出现了。此外，使用新一代的测序技术，能够鉴别出低频率的突变。低频率的突变株并不适合特定的环境。不过，病毒会形成储藏宿主使得病毒在不断变化的环境中快速适应。换句话说，有时也会有有益的突变出现，它们在病毒群中出现的频率会快速增长[8]。

rep基因是高度保守的，而cap基因含有更多的变异性。已有研究显示，来自一头猪的多克隆血清对同一基因型的不同分离毒株具有不同的抗体中和滴度。事实上，使用PCV2亚型毒株的单克隆抗体的研究，即使是单一的突变也可能导致抗原性不同的病毒。这些结果对PCV2这样的病毒而言并不令人惊讶，因为它具有高度的进化率。生物学差异，如抗体被中和，与病毒的序列并没有关系，而是取决于具体的病毒分离毒株。一些线性（在位点25～43，69～83，113～127，117～131，169～183和193～207）和构象（在位点47～85，165～200和230～233）的表位域已在Cap蛋白中被鉴定出来。已有研究显示在负或正选择下，这些区域含有位点。特别是非保守位点能在正选择下找到，这些被认为是宿主免疫系统的目标位点。PCV2蛋白中的保守域是它们发挥功能的必要位点[9]。

当前的一个挑战是了解PCV2疫苗接种对病毒进化的长期影响。从理论上说，有几个方面表明目前的疫苗可以影响到PCV2的进化。疫苗已被广泛应用，在几个重要的养猪大国如美国、德国、西班牙，疫苗覆盖了90%以上的猪只。猪群密度高使得各种传染性病原体的传播非常迅速。此外，尽管免疫了疫苗，PCV2仍然会传播，因为疫苗并不能够避免PCV2感染[10]。实际上，已有研究显示免疫和非免疫猪群中流行的PCV2在基因组上有所不同。此外，新出现的PCV2d毒株是在患有PCV2-SD的免疫猪群中发现的。不过，在人工感染试验中，当前使用的基于PCV2a的疫苗对PCV2d也是有效的。研究疫苗对病毒进化的作用，特别是病毒在免疫动物中能够出现仍然有大量工作要做。

[1]Kekarainen T,Gonzalez A,Llorens A,et al.Genetic variability of porcine circovirus 2 in vaccinating and non-vaccinating commercial farms[J].J Gen Virol,2014,95:1734-1742.

[2]Fort M,Sibila M,Pérez-Martín E,et al.One dose of a porcine circovirus 2(PCV2)sub-unit vaccine administered to 3-weekold conventional piglets elicits cell-mediated immunity and signi ficantly reduces PCV2 viremia in an experimental model[J].Vaccine,2009,27:4031-4037.

[3]Kekarainen T,Montoya M,Dominguez J,et al.Porcine circovirus type 2(PCV2)viral components immunomodulate recall antigen responses[J].Vet Immunol Immunopathol,2008,124:41-49.

[4]Darwich L,Segalés J,Resendes A,et al.Transient correlation between viremia levels and IL-10 expression in pigs subclinically infected with porcine circovirus type 2(PCV2)[J].Res Vet Sci,2008,84:194-198.

[5]Saha D,Del Pozo S R,Van Renne N,et al.Anti-porcine circovirus type 2(PCV2)antibody placental barrier leakage from sow to fetus:impact on the diagnosis of intra-uterine PCV2 infection[J].Virol Sin,2014,29:136-138.

[6]Koinig H C,Talker S C,Stadler M,et al.PCV2 vaccination induces IFN-gamma/TNF-alpha co-producing T cells with a potential role in protection[J].Vet Res,2015,46:20.

[7]Rose N,Grasland B,Bigault L,et al.Impact de la vaccination sur la transmission du Circovirus porcin de type 2(PCV-2)[J]. J Rech Por,2012,44:91-92.

[8]Cadar D,Cságola A,Lörincz M,et al.Detection of natural interand intra-genotype recombination events revealed by cap gene analysis and decreasing prevalence of PCV2 in wild boars[J]. Inf Genet Evol,2012,12:420-427.

[9]Kurtz S,Grau-Roma L,Cortey M,et al.Pigs naturally exposed to porcine circovirus type 2(PCV2)generate antibody responses capable to neutralise PCV2 isolates of different genotypes and geographic origins[J].Vet Res,2014,45:29.

[10]Opriessnig T,Gerber P F,Xiao C-T,et al.A commercial vaccine based on PCV2a and an experimental vaccine based on a variant mPCV2b are both effective in protecting pigs against challenge with a 2013 U.S.variant mPCV2b strain[J].Vaccine,2014,32:230-237.

（编辑：柳青）

每天喝适量咖啡益寿延年

【英国《每日电讯报》网站11月16日报道】一项新研究显示，每天喝3到5杯咖啡也许能够益寿延年。

科学家发现，适量饮用咖啡能够降低人们因心脏病、帕金森症等神经系统疾病和2型糖尿病而过早死亡的风险。

喝咖啡似乎还能降低自杀风险—但与癌症死亡率看似没有关联。

所喝的咖啡中是否含有咖啡因没有差别。据认为，咖啡的好处与咖啡中除刺激性物质之外的植物化合物有关。

领导这项研究的美国哈佛大学陈曾熙公共卫生学院科学家丁明（音）说：“咖啡中的生物活性物质会降低胰岛素抵抗和全身炎症反应。这也许能够解释我们的一些发现。不过，还需要进行更多研究以调查产生这些作用的生物学机制。”

发表在美国《循环》月刊上的这一研究成果源自对三项大型研究的汇总分析。共有208 501名男性及女性参与了正在进行中的这三项研究。

研究人员利用30年来每4年一次的饮食调查问卷对喝咖啡的影响进行了评估。

与较少喝咖啡或不喝咖啡相比，适量饮用咖啡能显著降低因各种原因死亡的风险。

这项分析还考虑到了可能影响研究结果的其他因素，包括吸烟、身体质量指数（BMI）、体育锻炼水平、饮酒和日常饮食。

研究报告的联合作者、陈曾熙公共卫生学院教授胡丙长说：“这项研究提供了进一步证据，证明适量饮用咖啡可能对健康有好处，降低因多种疾病而过早死亡的风险。”