知母中知母皂苷BⅡ的含量测定

孙丹丹，王春红，尹建元，陈凡波，李亨，孟勤

(吉林大学?a．药学院天然药物化学教研室；?b．药学院药学实验中心，长春?130021)

知母(Rhizoma Anemarrhenae)来源于百合科植物知母(AnemarrhenaasphodeloidesBge.)的根茎，具有清热泻火、滋阴润燥的功效，用于外感热病、高热烦渴、肺热燥咳、骨蒸潮热、内热消渴、肠燥便秘等症[1]。现代研究表明，知母中的化学成分主要为甾体皂苷、双苯吡酮类、木脂素类、多糖类等[2，3]，其中知母皂苷BⅡ为呋甾皂苷，是知母药材中的主要有效成分[4]。本实验考察了知母皂苷BⅡ的薄层色谱条件，为知母质量标准研究提供一定依据。因知母皂苷BⅡ结构中无共轭系统[4]，没有紫外吸收，故采用灵敏度较高的蒸发光散射器对其进行检测，建立了测定知母中知母皂苷BⅡ含量的高效液相色谱-蒸发光散射检测(HPLC-ELSD)方法[5～8]。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

Alltech 2000型蒸发光散射检测器(美国奥泰公司)；Series Ⅲ双泵高效液相色谱仪(美国SSI公司)；薄层板(青岛海洋化工厂分厂)；BT125D电子天平(0.01mg，德国赛得利斯公司)；KQ-250DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试剂

不同来源知母药材(吉林省仙草药材有限公司)。知母皂苷BⅡ对照品(上海融禾生物科技公司，批号：121011)。乙腈为色谱纯，其它试剂均为分析纯，水为纯净水。

2 方法与结果

2.1 薄层检测

取本品200mg，加30%丙酮1mL充分溶解，作为样品溶液；取知母皂苷BⅡ标准品200mg，加30%丙酮1mL充分溶解，作为对照品溶液；按薄层色谱法(中国药典2010版一部附录ⅥB)试验，吸取上述样品和对照品各2μL，依次点于同一块十八烷基硅烷键合硅胶薄层板上，以氯仿-甲醇-水(6∶4∶0.5)为展开剂，展开后，取出，晾干后喷以10%硫酸-乙醇溶液，在105℃下烘10min，取出，检视(图1)。

结果：样品和对照品展开良好，对照品知母皂苷BⅡ显色非常明显，样品与其在色谱相应的位置上显相同颜色的斑点。

2.2 知母皂苷BⅡ的含量测定

2.2.1对照品溶液的制备取知母皂苷BⅡ对照品适量，精密称定，加30%丙酮制成0.50mg/mL的溶液，即得。

图1 样品和标准品的薄层色谱图

Fig.1TLCchromatogramsofsampleandreferencesubstancesolution

2.2.2供试品溶液的制备取样品粉末(过三号筛)约0.15g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30% 丙酮25mL，称定重量，超声处理(功率400W，频率40kHz)30min，取出，放冷，再称定重量，用30% 丙酮补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液。

2.2.3色谱条件色谱柱为Alltima C18(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为乙腈-水(25∶75)，流速1.0mL/min，ELSD检测器漂移管温度为100℃，载气流速为3.0mL/min，柱温为室温25℃。按以上色谱条件得到对照品及样品色谱图，见图2、图3。

图2 对照品色谱图

图3 样品色图谱

2.2.4线性关系试验精密称取知母皂苷BⅡ对照品9.98mg，置25mL容量瓶中，加30%丙酮溶液使其溶解并稀释至刻度，摇匀即得浓度为0.4mg/mL对照品溶液。按照上述色谱条件依次进样5μL、10μL、20μL、50μL、100μL、200μL，测定其峰面积，以峰面积(Y)为纵坐标、进样量(X)为横坐标绘制标准曲线，回归方程为：Y=1871.4X+4649.1，r=0.9996。结果表明，知母皂苷BⅡ对照品在2.0μg～80.0μg范围内呈良好的线性关系。

2.2.5精密度试验分别取知母皂苷BⅡ对照品溶液，按照上述色谱条件连续进样6次，每次10μL，测定峰面积，结果RSD为1.2%，表明精密度良好。

2.2.6重复性试验取同一批次的知母药材，按“2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，取10μL 进样测定。结果知母皂苷BⅡ峰面积的RSD为1.8%，表明方法重复性较好。

2.2.7稳定性试验取供试品溶液，按照上述色谱条件分别在1h、5h、10h、15h进样10μL进行测定。结果知母皂苷BⅡ的RSD为0.6%，表明供试品溶液在15h内保持稳定。

2.2.8回收率试验精密称取已知含量的样品0.5g，置具塞锥形瓶内，分别加入相当于各被测物含量的80%、100%、120%的对照品储备液，按“2.2”项下方法制备低、中、高回收率样品各3份。测定知母皂苷BⅡ平均回收率分别为99.5%，RSD为1.89%。

2.2.9不同产地样品含量测定分别称取8个不同产地的样品，按“2.2”项供试品溶液的制备方法制备样品溶液，依上述色谱条件分别进样10μL，计算知母皂苷BⅡ的含量，结果见表1。

表1样品含量测定结果

Table 1The content of samples (n=2)

3 讨论

3.1 展开剂的改进

本实验除采用HPLC-ELSD方法对知母中的知母皂苷BⅡ定性定量的测定外，还进行了样品和标准品的薄层色谱对照，本实验考察了多种展开剂如：乙腈-水(1∶1)、正丁醇-乙酸乙酯-水(4∶1∶5)、氯仿-甲醇-水(7∶3∶1)，结果显示均不理想，在多次反复的实验中以氯仿-甲醇-水(6∶4∶0.5)为展开剂效果最为理想。此方法不仅完成了样品定性实验，而且对知母皂苷BⅡ柱层析分离方法提供了可靠的参考。

3.2 不同产地致含量差异

知母分布比较广泛，在我国主要分布于河北省、山西省、内蒙古自治区、辽宁省、黑龙江省、吉林省等地区[9]。因此，实验分别对8个不同产地的知母中知母皂苷BⅡ的含量进行了测定，由测定结果可见，不同地区知母所含知母皂苷BⅡ含量存在较明显差异。其中，河北易县、内蒙古赤峰样品中知母皂苷BⅡ含量较高。为了保证知母的用药质量，应考察不同产地的生长条件，尽量减小知母药材的质量差异或者在知母质量好的产地建立知母生产基地。

3.3 实验溶剂的优化

本实验采用HPLC-ELSD法测定知母中知母皂苷BⅡ的含量，选择丙酮作为溶剂，因为乙腈属于中等毒性的溶剂，毒性强于丙酮，且乙腈是易燃化学制剂，因此，丙酮便被选为本实验的溶剂，分别测定了30%、40%、50% 3种不同浓度的丙酮作为溶剂的知母皂苷BⅡ含量，结果显示，30%的丙酮为最适溶剂浓度，可用于知母皂苷BⅡ的质量控制与分析。

[1]国家药典委员会.中国药典2010年版:一部[K].北京:化学工业出版社,2010:2197-2198.

[2]边际,徐绥绪.知母化学及药理研究进展[J].沈阳药学院学报,1993,10(2):141-144.

[3]杨丽蓉.知母的化学成分及药理作用研究进展[J].国外医学:中医中药分册,2002,24(4):207-210.

[4]原源,陈万生,孙连娜,等.知母商品药材中的皂苷类成分含量测定[J].中国医院药学杂志,2006,26(6):656-658.

[5]沙东旭,刘兆妍,张满来,等.HPLC-ELSD法测定知母中知母皂苷BⅡ的含量[J].药物分析杂志,2009,29(12):2106-2108.

[6]容穗华,林海,高妮.不同产地知母有效成分含量的HPLC法测定[J].现代医院,2011,11(6):7-9.

[7]刘竞研,尹建元,张大伟,等.“参命源皂甙人参锭”中五种人参皂苷HPLC检测方法的建立及其评价[J].吉林大学学报:医学版,2014,40(2):450-453.

[8]耿聪,孙德亚,刘竞研,等.HPLC法测定人参强力胶囊中红景天苷的含量[J].特产研究,2012,34(4):61-62.

[9]钟可,王文全,靳凤云,等.HPLC-ELSD法同时测定河北产道地药材不同物候期知母中知母皂苷AⅢ和知母皂苷BⅡ的含量[J].中华中医药杂志,2013,28(6):1710-1713.