马鹿茸中水溶性蛋白质的含量测定及其影响因素考察

黄帮蕊，李佳芮，王春贺，金洋，马方圆，金向群※，高兵，常彤

(1．吉林大学药学院，长春?130021，?2．中国农业科学院特产研究所，长春?130112)

鹿茸为传统名贵中药，来源于鹿科动物梅花鹿或马鹿的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角[1]。鹿茸中的主要有效成分为多肽及蛋白类，在对鹿茸质量进行评价时，选择恰当的蛋白质检测方法十分重要。本试验主要对考马斯亮蓝显色法测定马鹿茸中水溶性蛋白质的含量进行了方法学考察，并研究马鹿茸储存时间、干燥方法等因素对其水溶性蛋白含量的影响，以期为马鹿茸的加工、存储提供参考，并为马鹿茸质量评价提供实验依据。

1 仪器与材料

UV-5500分光光度计(上海市元析仪器有限公司)；AB204-N分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；JT2001电子分析天平(上海精天电子仪器有限公司)；TGL-16M型离心机(江苏金坛市恒丰仪器制造有限公司)；YRD-100真空冷冻干燥机(上海玉成干燥设备有限公司)；PT-2010P-A烘箱(东莞市宝大仪器有限公司)。

牛血清白蛋白(纯度：98%，批号：20140415002，SIGMA公司)；考马斯亮蓝G-250(批号：131108，中国惠世生化试剂有限公司)；马鹿茸(长生鹿业有限公司)。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

对照品溶液的制备：精密称取牛血清白蛋白10.070mg，加水溶解并定容至10mL，即得。

供试品溶液的制备：取新鲜低温干燥马鹿茸粉末0.125g，用10mL蒸馏水润湿并充分搅匀，4℃静置48h，4℃ 6000r/min离心40min，取上清液，经0.45μm微孔滤膜过滤，即得。

考马斯亮蓝G-250溶液的制备：称取50mg考马斯亮蓝G-250，加95%乙醇25mL溶解，再加85%磷酸，用蒸馏水定容至500mL，即得。

2.2 水溶性蛋白的含量测定

2.2.1测定波长的选择在200nm～700nm范围内用紫外分光光度仪扫描牛血清白蛋白对照品及适宜浓度的供试品溶液，两者在594nm处都有最大吸收，因此，将594nm作为测定波长。

2.2.2标准曲线的绘制配制浓度为0.105mg/mL、0.210mg/mL、0.315mg/mL、0.420mg/mL、0.525mg/mL、0.630mg/mL、0.735mg/mL、0.840mg/mL一系列标准品溶液，分别取每个浓度的标准品溶液0.2mL，置10mL刻度试管中，加入考马斯亮蓝G-250显色剂4mL，混匀，放置10min，同法制备空白溶液，于594nm处测其吸光度。以牛血清蛋白浓度为横坐标X、吸光度为纵坐标Y绘制标准曲线，计算其回归方程为：y=0.0231x+0.1114，R2=0.995，牛血清蛋白线性范围为5μg/mL～40μg/mL(图1)。

图1 标准曲线

2.2.3含量测定结果分别精密量取供试品溶液0.2mL，共6份，置10mL刻度试管中，加入考马斯亮蓝G-250显色剂4mL，混匀，放置10min，于594nm处测其吸光度，根据回归方程计算样品中水溶性蛋白的含量为3.49%±0.31%。

2.2.4精密度试验精密量取供试品溶液0.2mL，置10mL刻度试管中，加入考马斯亮蓝G-250显色剂4mL，混匀，放置10min，于594nm处测其吸光度，连续测定6次，RSD为0.4713%，表明精密度良好(表1)。

表1精密度试验结果

Table 1Results of precision test

2.2.5稳定性试验精密量取供试品溶液0.2mL，置10mL刻度试管中，加入考马斯亮蓝G-250显色剂4mL，混匀，放置10min，于594nm处测其吸光度，分别于0min、10min、20min、30min、40min、60min时测定，结果RSD为0.5231%，表明供试品溶液在60min内稳定(表2)。

表2稳定性试验结果

Table 2Results of stability test

2.2.6重复性试验精密称取供试品药材6份，按“2.1”项的方法制备供试品溶液，各取0.2mL，置10mL刻度试管中，加入考马斯亮蓝G-250显色剂4mL，混匀，放置10min，于594nm处测其吸光度，测定并计算其水溶性蛋白含量，结果RSD值为1.2723%，表明方法重复性较好(表3)。

表3重复性试验结果

Table 3Results of repeatability test

2.2.7回收率试验分别取已知含量的供试品样品粉末各6份，精密称定0.1250g，按“2.1”项的方法制备供试品溶液，分别精密吸取供试品溶液各0.1mL，并分别加入对照品溶液，置10mL刻度试管中，加入考马斯亮蓝G-250显色剂4mL，混匀，放置10min，于594nm处测其吸光度，结果回收率为99.33%，RSD为0.8583%(表4)。

表4回收率试验结果

Table 4Results of recovery test

2.3 影响因素考察

2.3.1干燥方法影响考察结果对于不同的干燥方法(编号1、6)，低温干燥的马鹿茸水溶性蛋白含量为3.58%±0.42%，高温干燥的马鹿茸水溶性蛋白含量为1.47%±0.37%，对其进行独立样本t检验后发现，t=9.234，P=0.000，2组水溶性蛋白含量差异显著(P<0.05)。可见，干燥方法不同，马鹿茸中水溶性蛋白含量变化较大，高温干燥后水溶性蛋白含量明显下降(表5)。

表5不同处理条件下马鹿茸的水溶性蛋白含量

Table 5The content of water-soluble proteins in velvet antler under different processing conditions

2.3.2储存时间影响考察结果通过对放置0个月、3个月、6个月、9个月、12个月的低温干燥马鹿茸(编号1、2、3、4、5)的水溶性蛋白含量进行ANOVA方差分析后得，F=44.401，P=0.000，差异显著(P<0.05)，即不同的储存时间对马鹿茸中水溶性蛋白的含量有显著影响，存储时间越长，含量越少(表6、图2)。

表6储存时间考察结果

Table 6Results of Storage time ScS

3 讨论

鹿茸是药、食两用的药材，具有壮肾阳、强筋骨、益精血等滋补作用，是保健佳品；此外，还具有调冲任、托疮毒等作用。现代药理学研究表明，鹿茸能使大鼠离体心脏收缩幅度加大、改善心肌缺血程度，对血管内皮损伤也有良好的保护和修复作用。鹿茸还有促进伤口愈合、抗氧化、抗衰老、抗疲劳、增强免疫力等作用[2]。鹿茸中的主要有效成分为多肽及蛋白类，建立一种快速、准确地检测其蛋白浓度的方法必不可少。考马斯亮蓝显色法在许多实验中已成为用来定量检测蛋白浓度的首选方法，其与传统的测量方法相比，具有操作更简便、更快、更灵敏的优势，并且该方法测定蛋白时受其他试剂和非蛋白成分干扰较小[3]。应用考马斯亮蓝显色法测

图2 水溶性蛋白含量随储存时间变化图

Fig.2Thecontentofwater-solubleproteinsalongwithstoragetimechanged

定鹿茸水溶性蛋白的原理为：蛋白质分子均含有肽键，蛋白质的肽键能与考马斯亮蓝G-250染料上的阴离子结合，形成稳定络合物，溶液变为蓝色，此稳定络合物在594nm处吸光度与蛋白质含量成正比，因此594nm处测定吸光度，可计算出样品中蛋白质含量[4]。考马斯亮蓝G-250显色法中的染料对不同的蛋白质反应有差异，故测定时必须随行标准曲线或对照品溶液对照，以保证测定结果的准确、可靠[5]。

方法学考察结果表明，考马斯亮蓝与马鹿茸水溶性蛋白中的酰胺基团结合非常稳定，在60min之内吸光度值变化很小，精密度较高，重复性较好，同时，该方法的回收率符合要求，因此考马斯亮蓝显色法可作为马鹿茸水溶性蛋白含量的测定方法。

马鹿茸水溶性蛋白含量影响因素考察结果中显示，储存时间延长及高温干燥后均可导致水溶性蛋白含量的下降，其结果与刘淑娟[6]等报道的在所有储存条件下，鹿茸中水溶性蛋白含量均呈下降趋势的结果相似，导致这种结果的原因可能为随着储存时间延长或高温干燥后，鹿茸水溶性蛋白产生变性或变质，从而影响水溶性蛋白在水中的溶解度或其与考马斯亮蓝结合的能力。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[K].北京:中国医药科技出版社,2010:303.

[2]齐艳萍,李和平,陈雪龙.鹿茸药理作用的研究进展[J].经济动物学报,2008,12(1):53-55.

[3]王孝平,邢树礼.考马斯亮蓝法测定蛋白含量的研究[J].天津化工,2009,23(3):40-41.

[4]王文平,郭祀远,李琳,等.考马斯亮蓝法测定野木瓜多糖中蛋白质的含量[J].食品研究与开发,2008,29(1):115-117.

[5]董洁,郭立玮,文红梅,等.中药水提液中蛋白质含量测定方法研究[J].现代中药研究与实践,2009,22(6):41-42.

[6]刘淑娟,朱琼宇,赵晓祥,等.不同储存条件对鹿茸总糖和水溶性蛋白的影响[J].上海交通大学,2014,32(5):57-60.