蓝莓组织培养技术研究进展

2016-03-25罗兰艳范淑芳简大为

湖北林业科技 2016年1期

罗兰艳　范淑芳　简大为

摘要：本文对近几十年来的蓝莓组织培养技术进行综述，主要介绍了外植体的准备、培养基的选择、增殖及继代培养、生根培养和试管苗的移栽驯化等。

关键词：蓝莓；组织培养；研究进展

中图分类号：S663.9文献标识码：A文章编号：1004-3020（2016）01-0031-05

Abstract： We focused on recent advances in tissue culture of blueberry.The tissue culture of preparing explants，selecting of cultivation media， proliferation and subculture， rooting cultivation， transplanting and domestication of testtube plantlets were mainly introduced in this view.

Key words：blueberry；tissue culture；summary

蓝莓又名越橘、蓝浆果。杜鹃花科Ericaeae 越橘属Vaccinium的多年生小灌木。蓝莓果皮薄，酸甜味美，有独特风味和丰富的营养，被称为“浆果之王”[1]。蓝莓果实中含有多种生理活性成分如花色素苷、黄酮等，经常食用蓝莓可以有效地防止脑神经衰老和糖尿病等多种疾病的发生[2]，同时，食用蓝莓还具有增强心脏功能、明目以及抗癌等独特功效[3-4]。因此，蓝莓被联合国粮农组织列为五大健康食品之一[5]，已成为21 世纪最具发展前景的经济作物之一[6]。

在栽培上蓝莓属小浆果类果树，原产地和主产地均在北美洲，但广泛分布于北半球。蓝莓在我国约有 91 个种 28 个变种，主要分布于东北和西南地区[7]。目前，商业化种植的蓝莓品种主要有四大类：矮丛蓝莓、半高丛蓝莓、高丛蓝莓和兔眼蓝莓。其中高丛蓝莓主产于北美洲温带及亚热带，具有果实大、产量高、品质好等诸多优良品质，是全球最重要的商业化栽培种[8]。近几年来，高丛蓝莓又进一步被分为“南高丛蓝莓”和“北高丛蓝莓”两个亚类群[9]。

早在100多年前，美国人就开始了蓝莓的选育工作，到1937年就已经筛选出15个品种并进行了商业化的栽培[10]；到20世纪80年代，在全美境内就已选育出优良品种100多个，并分别在美国南部、东部、北部均形成了蓝莓产区[9-10]；进入21世纪，蓝莓就成为了美国主栽经济林之一。继美国之后，世界各国都开始引种栽培蓝莓，开展适合本国的蓝莓栽培技术研究和选育工作，并相继进入商业化栽培[11]。在亚洲，中国和日本是引种蓝莓并进行商业化种植发展较快的国家。我国蓝莓的应用最早可追溯至20世纪50年代，我国东北的‘笃斯蓝莓Vaccinium uliginosum被用来酿酒，但在当时人们并没有认识到蓝莓特殊的保健功效，所以没有对蓝莓的栽培引种工作进行系统研究，蓝莓也没有被作为水果进行推广和种植。直到20世纪80年代，吉林农业大学郝瑞教授最先率队对长白山地区的野生笃斯蓝莓资源进行全面系统地调查研究[12]，并开始野生蓝莓的驯化栽培。同时国内相关专家也积极开展蓝莓的国外引种栽培工作，1983年郝瑞教授首次从美国引进10余个蓝莓品种进行驯化栽培，此后国内多家科研单位、大专院校以及企业也陆续开展国外引种工作，对蓝莓的引种驯化、土壤改良和栽培管理等做了大量的研究，并逐步推广应用于生产[13]。

蓝莓作为一种具有保健功能的新兴水果逐渐被人们所接受，世界各国均十分重视蓝莓产业的发展。组织培养技术在蓝莓上的应用，对于蓝莓种质资源保护和开发利用具有极为重要的意义。通过组织培养和脱毒技术，可以获得比常规育苗更大量、更优质的种苗，满足市场上对蓝莓种苗的需求。对20世纪90年代以来蓝莓组织培养技术的研究进行总结概述，可以为进一步研究蓝莓的组织培养提供参考。

1外植体的准备

蓝莓组织培养中外植体的选择有很多，但大多数还是以幼嫩茎段和茎尖为主[14-15]，以叶片诱导不定芽为辅[16]，同时也有学者开展以子叶或上胚轴作为外植体诱导不定芽，以根作为外植体诱导植株再生的技术研究[17]。外植体选取后多采用70%～75%的酒精结合01%～05%的升汞、或1%～10%的次氯酸钠、或5%～20%的双氧水进行灭菌处理，均可获得较为理想的灭菌效果[15，18-22]。现有研究结果表明，以蓝莓的茎段和叶片为外植体进行组织培养应用最为广泛且效果最为理想。

2基本培养基的选择

根据现在已有的报道，蓝莓组织培养过程中所使用过的基本培养基种类较多，有MS培养基、1/2MS培养基、WPM培养基、改良WPM培养基、Anderson培养基、White培养基、Knops培养基、Z-2培养基和B5培养基等，研究结果显示没有一定之规，但均取得了较好的实验结果[15，23-30]。根据现有研究结果，蓝莓不同品种甚至同一品种不同的培养阶段利于蓝莓无菌苗生长的培养基均不相同，可能原因为蓝莓不同品种间及同一品种不同发育阶段的营养需求存在差异，在组织培养中应适当考虑。

3增殖及继代培养

蓝莓的增殖及继代培养过程中的影响因子，研究最多的是不同种类不同浓度的细胞分裂素、生长素对增殖及继代的影响。

3.1细胞分裂素的选择

董朝莉认为，在蓝莓茎段的离体增殖培养中，对其增殖培养影响较大的是细胞分裂素的种类和浓度，她的研究结果表明以加入1～2 mg·L-1 ZT或10～20 mg·L-1 2ip效果较好[18]；邵振中等认为，在兔眼蓝莓的增殖培养中，在WPM培养基中加入20 mg·L-1 ZT+05 mg·L-1 IBA，增殖系数可以达到80[31]；王淑珍等认为，在南高丛蓝莓的增殖培养中以加入1 mg·L-1 ZT为宜，在继代培养中以交替使用1 mg·L-1 ZT和2 mg·L-1 ZT为宜[32]；Alena 等在Anderson培养基中加入05 mg·L-1ZT进行五种高丛蓝莓的组织培养，最高的增殖系数达到了391[29] ；Lisa等比较了ZT、2ip和不添加激素对高丛蓝莓叶片增殖的影响，结果表明ZT的作效果更明显[35]。国内其他的相关研究也表明，蓝莓的增殖和继代培养中，ZT的作用效果最理想，甚至最高增殖系数可以达到50[19]。Barbara和Ana在改良WPM培养基中加入4 mg·L-1 ZT或10～15 mg·L-1 2ip均取得了成功，甚至有部分品种诱导成功率达100%[33]； Laura等和Line等分别在改良MS培养基和Z-2培养基上添加不同浓度的2ip进行蓝莓增殖培养，结果表明随着2ip浓度的增加增殖芽数增加[30，34]。现有研究结果表明，细胞分裂素中05～20 mg·L-1的 ZT可能较有利于蓝莓的组培增殖，较高浓度的 2ip也可促进蓝莓增殖，而且随着细胞分裂素浓度的增加增殖芽数也随之增加，与组培理论相符。但考虑到有效苗率，细胞分裂素的浓度仍需适当控制。

3.2生长素的选择

单独研究生长素对增殖及继代培养的影响的文献较少， Han等比较IBA和NAA 对蓝莓的增殖培养，结果表明IBA的效果要强于NAA[36]；Wojciech 和Magdalena比较了IBA和IAA对蓝莓的增殖培养，结果表明IBA的效果要强于IAA [37]。在增殖培养过程中生长素的应用较为广泛，邵振中等、朱宏芬等使用IBA[31，38]配合不同的细胞分裂素，增殖系数可达到5.8～8.0；陈平芬等、宁志怨等、Cao等使用NAA[39-41] 配合不同的细胞分裂素，增殖系数可达到3～4，Line等使用IAA[30] 配合2ip也取得了较好地效果。现有研究结果说明，生长素可能不为影响蓝莓增殖的主导因子，IBA、NAA、IAA在蓝莓增殖中均可取得较好的效果，但相对而言IBA效果可能更好。

3.3pH值的选择

在pH值对增殖培养的影响上，普遍认为蓝莓为酸性植物，所以组织培养的各阶段，pH值的应用大多在4.8～5.6范围内，而pH值对增殖培养的影响研究较少，廉家盛认为最适合‘美登增殖的培养基pH值为5.4[28]。Maria 等分别试验了不同pH值（40，45，50，55，60）对蓝莓增殖培养的影响，结果表明对于不同的蓝莓品种最适宜的pH值不同，对‘Koralle最适宜 pH值为55，而对‘Red Pearl最适宜pH值为40[42]。现有研究结果表明，蓝莓组培中应根据不同品种的需求来选择适宜的PH值，但总体而言以偏酸性为主。

4 试管苗的生根培养

4.1瓶内生根培养

从目前的研究可以看出，对于培养大多数采用1/2 WPM培养基添加不同浓度的IBA[43-45] ；也有人用其它培养基进行诱导生根取得了成功，Takuya等认为WPM是最合适的生根培养基[26]；Maria等用Anderson培养基也成功诱导生根[42]。

在IBA的使用浓度上，绝大多数认为是添加05 mg·L-1 IBA最有利于生根培养[31，43，46-48] 。但也有研究表明低浓度的IBA更有利于生根，孙书伟认为，“蓝丰”在添加01 mg·L-1 IBA的培养基中，28 d后生根率可达100%；“伯克利”在添加005 mg·L-1 IBA的培养中，32 d后生根率也可以达到100%[49]。同时，也有研究表明高浓度的IBA更有利于生根培养，张彩玲认为，在添加10 mg·L-1IBA的培养基中，“美登”的生根率可以达951%[44]；约旦等、Maria等认为，诱导蓝莓生根的最宜IBA浓度是20 mg·L-1[42，50]。还有研究表明，配合使用多种生长素更有利于生根培养。杨艳敏等认为，在相同条件下，使用单一的IBA，生根率最多可以达到6133%，但如果在添加05 mg·L-1 IBA的同时加入010～015 mg·L-1 NAA，生根效果更好，生根率可以达到6733%～7267%，且生根速度也快[43]。在pH值对蓝莓生根的影响上，梁晓晶认为pH值对生根率影响显著，且笃斯越橘的最佳生根培养基pH值为48～60[51]。综合上述研究结果，说明影响蓝莓生根的主导因子为生长素，而且不同品种间的需求不同，但多数学者认为IBA更有利于蓝莓的生根培养，且少量学者认为IBA搭配少量的NAA可能更为利于蓝莓生根。

4.2瓶外生根培养

目前大多数研究结果表明，蓝莓瓶外生根培养技术较为成熟，在工厂化生产中大多使用瓶外生根培养。选用增殖培养的健壮幼枝，将培养基清洗干净，用适当的生长调节剂处理后，扦插于适宜的生长基质中，给予其合适的外部生长条件，可以促进其快速生根。刘庆忠、姚平等认为，将试管苗幼枝用IBA快速处理后，扦插于腐苔藓基质上，然后扣上小拱棚置于温室中，小棚内湿度控制在85%～95%，20～28 ℃，培养20 d后就可以生根，并且长势较好[52-53]。大多数的研究则表明，在外部环境控制较好的情况下，培养基质对瓶外生根的影响较大。张贤萍认为，在椰糠和水苔按体积比6∶4的混合基质中，诱导瓶外生根效果最好，其生根率高达96%以上[54]；王会认为，在苔藓和河沙按体积比2：1的混合基质中，诱导瓶外生根效果最好，其生根移栽成活率可达到904%[55]；程淑云、黄国辉等认为，不同生根基质对瓶外生根率有较大影响，在苔藓上生根率最高[56-57]。综上所述，在蓝莓进行瓶外生根培养时，应着重考虑培养基质与温湿环境的影响，同时对试管苗幼枝配以适宜的生长素处理，可以达到较好的生根效果。利用瓶外生根技术可以减少瓶内生根的无菌操作过程，明显节约人力和物力、降低生产成本，在组培生产中可以优先考虑。

5其它培养条件或添加物的选择

在试管培养的增殖和生根阶段，有研究学者也对培养过程中可能影响到增殖或生根的其他因素进行了探讨。宋刚认为，蓝莓在诱导生根的过程中，先进行7 d的暗培养再进行光照培养或增加继代代数达到5代后，生根率均会明显提高[58]。邵振中等认为光照强度对兔眼蓝莓的增殖系数影响不大，但在小于2 000 Lx的光照强度下，玻璃化现象会随光照加强而减弱，所以建议增殖培养光照强度为2 000～3 000 Lx[31]。邵振中、王平红等均对活性炭对蓝莓的生根进行了研究，邵振中等认为，活性炭对兔眼蓝莓生根有抑制作用[31]；王平红认为，在培养基中添加1%～2% 活性炭，有利于诱导蓝莓生根，但当培养基中添加活性炭的用量超过2%时，并不利于其生根，生根率反而会下降[59]。现有研究结果说明，光照、活性炭等对不同品种蓝莓的组培可能也有影响，在组培研究中应酌情考虑。

6试管苗的驯化移栽

蓝莓试管苗的驯化移栽技术较为成熟。李京等认为，温度对试管苗的移栽成活有较大影响，当温度升高（<25 ℃）时，有利于移栽成活；研究结果表明，9～10月是移栽的最佳季节，控制驯化室温度25 ℃、温度75%、遮光30%的条件下，将试管苗用500 mg·L-1的ABT处理30 s后栽于1∶1的沙子和草炭土的混合基质中，移栽成活率可达到970%[60]。董朝莉对蓝莓移栽驯化进行了对比试验后认为，季节和空气湿度对移栽成活率影响较大，她认为春秋季节是适合移栽的季节、当空气湿度达94%～98%时也明显有利于成活率，在生产中可在苗床上再搭一小拱棚并覆盖一层透明薄膜[18]。此外，国内对移栽基质的试验研究较多，得出适合蓝莓移栽的基质也较多，有园土、腐殖土、废苔藓按1∶3∶1比例的混合基质[44]；有腐殖菌根土、珍珠岩按3∶2比例的混合基质[61]；有纯腐苔藓[14，32]等。综上所述，蓝莓试管苗的驯化移栽技术与其瓶外生根技术相类似，应着重考虑培养基质及光照、温度、湿度等环境条件的影响，同时配以适宜的生根剂处理，可以达到更好的效果。

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