微卫星不稳定在结直肠癌的研究进展*

李悠然 综述，谷云飞 审校

(1.南京中医药大学第一临床医学院，南京 210046；2.南京中医药大学附属医院肛肠外科，南京 210029)



·综述·

微卫星不稳定在结直肠癌的研究进展*

李悠然1综述，谷云飞2△审校

(1.南京中医药大学第一临床医学院，南京 210046；2.南京中医药大学附属医院肛肠外科，南京 210029)

结直肠肿瘤；微卫星不稳定；错配修复;进展

结直肠癌是最常诊断的肿瘤之一，其发病率在欧洲据第2位，在美国据第3位[1]。在未来20年中发展中国家结直肠癌发生率预期逐渐升高，原因与西化的生活方式、缺少检查等有关。近年来随着人民生活水平的提高和膳食结构的改变，我国结直肠癌发病率和病死率均呈上升趋势。研究表明，结直肠癌是多种癌基因突变或抑癌基因失活累积导致基因组不稳定的结果[2]，目前基因组不稳定主要有以DNA微卫星重复序列长度改变为特征的微卫星不稳定(microsatellite instability，MSI)和整个或部分染色体变异为特征的染色体不稳定(chromosome instability,CIN)两种途径。结直肠癌遗传学研究显示约15%的原发性结直肠癌系MSI所致，其中约20%(总体结直肠癌的2%～4%)是林奇综合征(Lynch syndrome)，这意味每35例结直肠癌患者中就有1例林奇综合征患者。在大部分林奇综合征和大约15%散发性结直肠的发病机制中MSI起到了决定性的作用[3]。因此，对MSI的深入研究有助于从分子遗传学角度认识结直肠癌。通过回顾相关文献，本文对其分子机制、检测适应证及方法、在结直肠癌的分类，以及临床意义进行综述。

1　MSI的分子机制

微卫星(microsatellite,MS)是DNA基因组中小于10个核苷酸的简单重复序列，又称短串联重复(short tandem repeat,STR)，随机均匀分布于人类基因组的内含子、间隔区、外显子及调控区，核心序列为1～6 bp，重复次数不超过60次，片段长度通常小于350 bp。尽管MS在个体之间存在高度的多态性，但在个体内部保持一定的遗传稳定性(孟德尔共显性遗传)，因此，MS是重要的一类遗传标记，可以用于遗传性疾病的连锁分析和基因诊断。位于基因组的非编码区的MS通常认为其遗传突变属于选择性中性，但近来研究表明在选择性的压力下，可使细胞向恶性转变，并且对基因组的结构产生影响[4]。位于编码区的MS易于出现复制滑脱(比一般编码区中其他基因的发生概率高10～100倍)[5]，当突变、缺失或者表观沉默导致错配修复(mismatch repair，MMR)基因失去功能，从而不能修复DNA复制过程中滑动链与互补碱基出现的错配，导致一个或几个重复的碱基插入或缺失，进而产生MSI表型。由于DNA错配修复缺陷(defective DNA mismatch repair，dMMR)[6]增加了编码区MS的移码突变概率，导致基因组的不稳定。因此，当编码区MS序列中涉及参与DNA修复(例如hMSH3、hMSH6)、DNA损伤反应(例如CHK1、MRE11A)、细胞的凋亡(例如BAX、Caspase5)以及信号的转导(例如TGFβRⅡ、IGF2R)的基因时，这些重要基因发生突变的概率变大，MSI表型就具有发展成肿瘤的潜能。现有研究表明错配修复基因缺失的结直肠肿瘤中位于编码区域的MS序列中至少40个基因已发生突变[7]。因此，MS序列在编码区域发生突变被认为是MSI肿瘤的重要分子机制。

2　MSI在结直肠癌的分类

2.1根据分子机制分类根据结直肠癌的分子机制，可分为两种类型[8]。存在于大约15%的散发性结直肠肿瘤。其原因是MLH1基因启动子甲基化导致MMR基因沉默，最终MMR相关蛋白表达阴性，产生MSI表型。存在于大部分的林奇综合征(占结直肠癌总数的2%～5%)。由于该病是由胚系MMR基因(hMLH1、hMSH2、hMSH6、hPMS2、hMSH3 和hPMS1)突变导致，其中MLH1、MSH2基因最易发生突变，占林奇综合征患者的85%～90%，故90%以上表现MSI[9]。

2.2根据MSI的检查方法分类根据美国国立癌症研究院协作组推荐的MSI的检测方法(即通过PCR方法扩增5个特定的微卫星位点标志物)，可分为以下3种类型，高频微卫星不稳定(MSI-H):5个标记位点中有2个及以上的标记显示不稳定或多个标记位点中30%及以上的标记显示不稳定；低频微卫星不稳定(MSI-L):5个标记位点中有1个的标记显示不稳定或多个标记位点中10%～30%的标记显示不稳定；微卫星稳定(MSS):所有标记均显示稳定。一般认为MSI发生在单、双核苷酸重复序列，故上述检测方法采用的检测位点为2个单核苷酸重复序列和3个双核苷酸重复序列。但最近有资料表明实际上存在一种以四核苷酸重复序列为主的MSI类型，被称为选择性四核苷酸高度微卫星不稳定(elevated microsatellite alterations at selected tetranucleotides,EMAST)。尽管在MSI研究领域中，对于四核苷酸重复序列的研究深度尚未达到单核苷酸重复序列和双核苷酸重复序列的研究水平，但已证实在结直肠肿瘤组织中有EMAST现象发生，而且EMAST在直肠癌中出现的概率高于MSI-H[10-11]。

3　MSI的检测

3.1MSI的检测适应证2004年修订完成的改良贝斯塔(Bethesda)指南包含了家族史、肿瘤特征在内的临床标准和病理标准。近10年中，逐渐被临床医师应用于筛查需要接受MSI检测的患者。2014年美国遗传性/家族性高危结直肠癌临床实践指南[12]和2015年美国胃肠学会发布的遗传性消化道肿瘤综合征管理指南[13]都再次强调了对符合改良Bethesda指南中至少1项标准的结直肠癌患者应接受MSI检测，可见其在筛查MSI结直肠癌中的价值。因此，目前MSI的检测适应证基本参考改良Bethesda指南，其标准具体如下：(1)确诊结直肠癌时年龄小于50岁；(2)不论发病年龄，患有同时性或异时性的结直肠癌或其他林奇综合征相关肿瘤(子宫内膜癌、胃癌、卵巢癌、胰腺癌等)；(3)确诊结肠癌时年龄小于60岁且经组织学诊断为MSI-H表型(肿瘤侵润淋巴细胞、克罗恩病样淋巴反应、黏液细胞/印戒细胞分化、髓样生长模式)；(4)确诊结直肠癌患者的一级亲属中至少1例确诊为林奇综合征相关的肿瘤且有1例肿瘤发生于50岁前；(5)不论年龄，确诊结直肠癌患者的一级亲属或二级亲属中2例或2例以上确诊为林奇综合征相关的肿瘤。

尽管目前改良Bethesda指南是作为MSI的检测适应证，但是也有文献研究发现其对林奇综合征筛查的敏感性不足。1项基于挪威人群的研究将336例确诊结直肠癌患者分别按照改良Bethesda和阿姆斯特丹(Amsterdam)Ⅱ标准进行分组且所有确诊结直肠癌患者均接受MSI的分子学检查。结果显示改良Bethesda敏感性50%(95%CI,21%～79%),特异性75%(95%CI,70%～80%)，阳性预测率7%(95%CI,3%～14%)；AmsterdamⅡ敏感性25%(95%CI,6%～57%),特异性98%(95%CI,96%～99%)，阳性预测率38%(95%CI,9%～76%)[14]。另一项包含2 093例患者的大型队列研究也表明改良Bethesda的敏感性不够，大约15%的林奇综合征会被漏诊[15]。2014年美国遗传性/家族性高危结直肠癌临床实践指南也指出尽管改良Bethesda指南比Amsterdam标准更敏感，但也有50%的林奇综合征会被漏诊。因此，有学者认为对于所有确诊的结直肠癌均应接收MSI的分子学检查。

3.2MSI的检测方法新鲜的、冷冻的或者石蜡包埋过的肿瘤组织都可被用来进行MSI检测。MSI检测方法主要是PCR技术和免疫组织化学(IHC)技术。

3.2.1PCR技术目前临床主要采用多重荧光PCR结合毛细管电泳进行MSI检测。MS位点经过荧光标记的PCR扩增后经遗传分析仪毛细管电泳进行基因组扫描，通过检测片段长度来判断MIS[16]。

1998年，美国国立癌症研究院协作组推荐2个单核苷酸位点(BAT-25、BAT-26)和3个双核苷酸位点(D2S123、D5S346、D17S250)作为MSI检测的标记点，但由于[17]双核苷酸位点具有多态性，在超过1%的群体中重复单位的数目表现杂合性，为了提高MSI检测的准确性，故推荐病理学家从肿瘤组织周围的正常组织或者抽血提取DNA与肿瘤组织配对进行MSI检测 。

2004年，新的专家共识意见中推荐5个准单态性的单核苷酸位点(BAT-25、BAT-26、NR21、NR24、NR27)作为MSI检测的标记点。其原因是研究发现单核苷酸标记位点在大部分个体的等位基因中重复单位的数目是相同且恒定，故单核苷酸标记位点可被看作准单态性[17]。因此，采用单核苷酸标记位点进行MSI检测，无需对肿瘤组织配对正常组织的DNA进行MSI检测，不但可以提高MSI检测的敏感性,而且降低成本和时间损耗。

自此，寻找新的准单态性的单核苷酸位点成为研究的热点。2005年有学者不但发现了新的准单态性的单核苷酸位点CAT25，而且研究表明仅采用3个单核苷酸位点(BAT-25、BAT-26、CAT25)检测的敏感性和特异性可以与之前美国国立癌症研究院协作组推荐的2个单核苷酸位点和3个双核苷酸位点的方法等同。2012年又有学者发现了新的单核苷酸位点MT1XT20,初步的研究表明其具有不错的敏感性和特异性[18]。

目前最新研究表明采用4个双核苷酸位点和6个单核苷酸位点的方法进行MSI检测，其准确性较之前的方法更高[19]。

3.2.2IHC技术临床上，采用IHC检测4种MMR基因(hMLH1、hMSH2、hMSH6、hPMS2)的蛋白表达情况来明确是否存在MSI。正常情况下，IHC可检测4种蛋白的表达。如果IHC检测结果异常表明至少有一种蛋白没能表达，可能存在相关MMR基因的突变。由于人类的MMR系统一般优先通过hMutSα(hMSH2和hMSH6组成的聚合物)和hMutSβ(hMSH2和hMSH3组成的聚合物)形成的异二聚体识别复制过程中产生的错误，然后招募hMutLα(hMLH1和 hPMS2组成的聚合物)启动DNA修复过程[20]。因此，IHC检测结果异常后需要采用PCR技术对其基因进行MSI检测以发现突变的MMR基因或相关的蛋白聚合物。若IHC检测发现MLH1蛋白未能正常表达的情况，往往还需要BRAF基因突变检测或MLH1甲基化检测来明确是遗传性胚系来源还是散发性来源的MSI结直肠癌。

IHC检测MSI具有很好的敏感性(大于90%)和特异性(100%)，假阴性率5%～10%，具有简单、快速、花费低的特点。临床上经常联合使用IHC技术和PCR技术检测MSI，且两者之间存在很好的相关性。

4　临床应用MSI检测在结直肠癌的意义

4.1参与林奇综合征的筛查及诊断林奇综合征是一种由dMMR所致的常染色体显性遗传疾病[21]，既往曾被命名为遗传性非息肉性结直肠癌(hereditary nonpolyposis colorectal cancer,HNPCC),以强调其遗传性和有别于家族性腺瘤病。其临床特征是发病较早的结直肠癌肿瘤(平均发病年龄为45岁，明显低于健康人群的平均发病年龄60岁)及发生其他肿瘤(诸如子宫内膜癌、胃癌、卵巢癌、尿道肿瘤、肝胆肿瘤、胰腺肿瘤以及小肠肿瘤)的危险性增加。林奇综合征患者一生中患结直肠的可能性约50%～80%[22]，且多为同时性或异时性的结直肠癌。

2014年美国遗传性/家族性高危结直肠癌评估指南指出对于年龄大于70岁符合Bethesda指南的结直肠癌患者和所有初诊小于等于70岁的结直肠癌患者都应进行林奇综合征筛查(例如IHC和MIS检测)。林奇综合征的诊断主要基于MMR基因的胚系突变，最新一项研究表明简化的临床标准[23](满足其一即可：小于50岁的结直肠癌患者；具有结直肠癌或子宫内膜癌病史，直系亲属具有结直肠癌或子宫内膜病史)加常规免疫组化检测及MSI检查初筛，再行BRAF V600E突变及胚系基因突变检测确诊，能极大地提高林奇综合征的预测检出率。

4.2MSI对预后具有指导意义随着大样本临床试验及Meta分析结果的公布，MSI作为结直肠癌的预后指标的价值已得到广泛的文献支持。2003年一项包含5个随机临床试验(570名Ⅱ～Ⅲ期结肠癌患者)的回顾性研究证实了MSI是预后的影响因素。这一结论也得到后续研究的佐证。一项包含7 642例患者的Meta分析显示与MSS患者相比，MSI阳性患者的死亡风险比(hazard ratio,HR)为0.65(95%CI0.53～0.69)；分层分析显示在Ⅱ期和Ⅲ期的结直肠癌中，MSI阳性患者的死亡HR为0.67(95%CI0.58～0.78)[24]。另外一项Meta分析研究(包含31项相关研究，12 782例患者)表明MSI阳性结直肠癌相关总体生存率的总体比值比(OR)为0.6(95%CI0.53～0.69，P<0.01)；对比无瘤生存率结果相似(OR=0.58,95%CI0.47～0.72，P<0.01)[25],从而明确MSI表型与良好预后之间的确定性关系。

尽管MSI对结直肠癌的预后价值已得到佐证，流行病学研究也显示MSI阳性的结直肠癌多见于Ⅱ期和Ⅲ期，但是MSI对哪一期结直肠癌的预后影响价值更大，目前尚存在分歧。2009年美国临床肿瘤学会上的PETACC-3临床研究结果显示相比Ⅲ期结肠癌，MSI对Ⅱ期结肠癌的预后影响价值更大。2011年一项包含2 141例Ⅱ期到Ⅲ期的结直肠癌患者的多元回归分析显示在Ⅲ期结直肠癌中,无病生存期(HR=0.76;95%CI:0.58～1.00;P=0.047)，整体生存期(HR=0.76;95%CI:0.59～0.99;P=0.041)；在Ⅱ期结直肠癌中,无病生存期(HR=0.83;95%CI:0.57～1.21;P=0.339)，整体生存期(HR=0.81;95%CI0.55～1.18;P=0.266)[26]。据此，研究者得出了MSI对Ⅲ期结肠癌的预后影响价值更大的结论。

4.3MSI与化疗的关系

4.3.1对5-氟尿嘧啶(5-Fu)为基础的化疗方案的疗效2009年一项Meta分析调查了7项研究中3 690例接受和未接受5-Fu为基础化疗的结直肠癌患者(810例Ⅱ期及2 444例Ⅲ期)，其中454例MSI阳性患者。结果表明在MSI阳性患者中，是否接受化疗对患者的无复发生存率差异无统计学意义(HR=0.96;95%CI:0.62～1.49),总生存率(HR=0.70;95%CI:0.44～、1.09;P=0.12)。2010年Sargent等[21]研究对457例Ⅱ期或Ⅲ期结肠癌患者采用5-Fu为基础化疗方案治疗，结果显示MMR缺陷的患者接受辅助化疗并没有显示出较单纯手术更好的无瘤生存率，并且在MMR缺陷的Ⅱ期结肠癌患者中，术后化疗反而降低了总体生存率。研究者根据结果推断在Ⅱ期结肠癌中，MSI可以作为预测患者能否从化疗中受益的标志物。因此，2015年版美国国立综合癌症网络(national comprehensive cancer network,NCCN)指南指出Ⅱ期MSI结肠癌患者不应该接受5-FU为基础的化疗方案。但是，对于Ⅱ期结肠癌中MSI作为预测患者能否从化疗中受益的指标的观点尚存在争议。一项包含1 913例Ⅱ期结肠癌患者的研究表明MSI仅是预后指标，但不能预测患者从化疗中受益还是受损[27]。

然而，MSI结肠癌患者不应该接受5-FU为基础的化疗方案的结论似乎不适用于Ⅲ期结肠癌。来自法国的一项多中心回顾性研究评估了MSI表型对Ⅲ期结肠癌患者接受FOLFOX化疗方案的影响[28]。结果显示在3年无病生存率方面，MSI阳性患者(90.5%)明显高于MSI阴性患者(73.8%)，多元回归分析显示MSI是无病生存率的独立预后指标。同样来自法国对Ⅲ期结肠癌的一项研究也得出了相似的结果[29]，在3年无病生存率方面，接受FOLFOX化疗方案的MSI阳性患者(100%)明显高于MSI阴性患者(80.3%)，但是多元回归分析未发现MSI是无病生存率的独立预后指标。2015年美国临床肿瘤学会(American Society of Clinical Oncology,ASCO)年会中报道了PETACC8和NCCTG N0147辅助试验中，经FOLFOX+/-西妥昔单抗治疗患者的Ⅲ期结肠癌DNA错配修复与临床预后分析的结果[30]。MMR缺陷患者与MMR完整患者的3年无病生存率为75%vs. 74%(HR=0.87；95%CI：0.71～1.07；P=0.196)。肿瘤dMMR患者的无病生存率与肿瘤DNA错配修复完整(proficient DNA mismatch repair，pMMR)且无BRAF或KRAS基因突变患者的无病生存率类似。其研究者认为MMR状态与临床预后无关。因此，Ⅲ期MSI结肠癌患者可以从5-Fu为基础的化疗方案中获益。

4.3.2对伊立替康为基础的化疗方案的疗效PETACC-3结肠癌临床实验表明在Ⅲ期结肠癌患者中，伊立替康联合5-Fu和(或)甲酰四氢叶酸并没有比单纯使用5-Fu和(或)甲酰四氢叶酸者有更高的5年生存率。在此临床实验的基础上，2009年ASCO会议上报道对1 254例患者的回顾性研究结果表明在无瘤生存率和总生存率方面，MSI对于接受伊立替康联合5-Fu化疗方案的患者具有很好的预后价值，尤其是对于Ⅱ期结肠癌患者。但对于MSI患者，伊立替康联合5-Fu化疗方案和5-Fu单独用药结果并无差异。因此，伊立替康为基础的化疗方案对MSI患者的敏感性尚存在争议。

MSI检测主要被临床应用于林奇综合征的筛查及诊断、对结直肠癌预后的判断及预测对化疗方案的疗效。尤其对于Ⅱ期结肠癌，MSI表型意味着良好的预后，以及不能从5-Fu为基础的化疗方案收益。MSI检测有利于临床医师制订有效的治疗方案，从而让患者从中受益。

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10.3969/j.issn.1671-8348.2016.13.048

国家自然科学基金资助项目(81473565)；江苏省“十二五”中医药重点学科基金资助项目(JS1301)；江苏省中医消化病临床医学研究中心项目(BL2014100)。作者简介：李悠然(1988-)，在读博士，主要从事肛肠外科研究。△

，E-mail:guyunfei127@126.com。

R735.3+4

A

1671-8348(2016)13-1855-05

2015-11-13

2016-01-13)