二甲基硫醚氧化菌的分离鉴定及其对猪粪堆肥的影响

郭彦钊，付瑞敏，2，薛婷婷，谷亚楠，马玮超，陈五岭*（.西北大学生命科学学院，西安70069；2.河南教育学院生命科学系，郑州450046）



二甲基硫醚氧化菌的分离鉴定及其对猪粪堆肥的影响

郭彦钊1，付瑞敏1，2，薛婷婷1，谷亚楠1，马玮超1，陈五岭1*
（1.西北大学生命科学学院，西安710069；2.河南教育学院生命科学系，郑州450046）

摘要：从污水处理厂活性污泥中分离得到一株二甲基硫醚（DMS）氧化菌AM2，经16S rDNA检测鉴定其为那不勒斯硫杆菌（Thiobacillus neapolitanus）。AM2的最适生长温度为30℃，最适pH为7.0。以猪粪和秸秆粉为原料进行肥料堆肥试验，通过检验菌株AM2对堆肥过程中DMS排放量、堆肥温度、可培养微生物和酶活性的影响，来探究菌株AM2对堆肥的影响。结果表明：接入菌株AM2的实验组DMS释放量显著（P＜0.05）少于对照组，在30 d的实验中有20 d减少60%以上；显著提高了（P＜0.05）可培养微生物数量，同时将物料温度高于50℃的天数延长至13 d；实验各组的脲酶、脱氢酶、过氧化氢酶、蛋白酶和纤维素酶酶活都显著高于对照组。综合判断，菌株AM2能够有效降低堆肥过程中DMS的排放量并促进肥料腐熟。

关键词：二甲基硫醚；那不勒斯硫杆菌；16S rDNA；猪粪堆肥；酶活

郭彦钊，付瑞敏，薛婷婷，等.二甲基硫醚氧化菌的分离鉴定及其对猪粪堆肥的影响[J].农业环境科学学报, 2016, 35（2）：372-379.

堆肥是处理有机废弃物的一种理想方法，但堆肥过程会释放大量的恶臭物质污染大气，影响周围居民的正常生活甚至导致疾病。Dai等[1]分析了猪粪堆肥过程中释放的气体中主要的致臭物质，二甲基硫醚（DMS）是其中之一。

二甲基硫醚是典型的有机硫恶臭气体，它在空气中的含量达到十亿分之一便可产生臭味[2]，并且它的产生会抑制堆肥过程中微生物的生长[3]，对肥料的发酵产生不利的影响。目前DMS的生物消除法大都需要装有活性污泥的气体吸收设备，这些方法的局限性是没有在根源上抑制DMS的产生，并且需要气体收集和吸收设备而增加生产成本，不利于有机肥料产业的发展。相比于现有的方法在堆肥过程中加入特殊微生物，利用微生物的新陈代谢过程将堆肥过程中产生的DMS分解或转化为其他无臭物质不失为一种新的思路。Wang等[3]从活性污泥中分离得到的一株化能自养硫杆菌（ChemolithotrophicThiobacilli），对通入滴滤塔中的DMS气体在24 h内可以完全净化。

本实验的主要目的是选育出一种能够在堆肥物料中生存并且能够氧化利用DMS的菌株。因为微生物和酶是分解有机物的主体[4]，并且物料温度能够反映生物活性，所以通过监测堆肥实验过程中释放的废气中DMS的含量、堆体温度、微生物量和酶活性，可验证筛选出的菌株能否应用在实际的堆肥中。

1　材料与方法

1.1材料与培养基

活性污泥取自西安第四污水处理厂；猪粪取自西安鑫源种猪厂。物料性状如表1所示。

表1　物料性状Table 1 Basic properties of composting materials

Na2S2O3无机盐培养基[5]：KH2PO42 g，K2HPO42 g，NH4Cl 0.4 g，MgCl2·6H2O 0.2 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，Na2S2O3·5H2O 8 g，琼脂20 g，水1000 mL。

牛肉膏培养基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂15 g，水1000 mL。

马丁氏培养基：KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，蛋白胨5 g；葡萄糖10 g，1%孟加拉红水溶液3.3 mL，1%链霉素溶液3 mL，琼脂15 g，水1000 mL。

高氏一号培养基：可溶性淀粉20 g，KNO31 g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O0.5 g，NaCl0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，霉菌素0.03 g，K2Cr2O70.02 g，奈啶酮酸0.01 g，琼脂15 g，水1000 mL。

1.2菌种分离与鉴定

取活性污泥1 g接入200 mL Na2S2O3无机盐液体培养基中，31℃、180 r·min-1培养24 h，再吸取10 mL培养液转接入新的Na2S2O3无机盐液体培养基中，重复3次；利用第3次的培养液在Na2S2O3无机盐平板培养基上涂平板，31℃恒温培养72 h后挑取得到的单菌落做纯化培养。再利用Na2S2O3无机盐液体培养基对初筛出的菌株进行复筛，在31℃、180 r·min-1的恒温摇床培养箱中培养48 h，利用铬酸钡分光光度法测定培养基内SO2-4浓度[6]，选出氧化能力最高的一株菌株进行后续研究。

显微镜观察菌体形态，参照微生物学试验、《常见细菌系统鉴定手册》[7]和《伯杰氏细菌鉴定手册》[8]对筛选菌株进行初步的形态学鉴定。提取菌株的总基因组DNA作为模板，使用细菌16S rDNA通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'）和1492R （5'-CTACGGTTACCTTGTTACGAC-3'）进行PCR扩增。PCR反应体系25 μL，热循环参数如下：94℃预变性3 min，再以94℃变性1 min、55℃退火1 min、72℃延伸2 min为循环，循环30次后，72℃延伸10 min。通过琼脂糖凝胶电泳回收目的条带，并与pMD18-T载体连接，转化E.coli DH5的感受态细胞，菌落PCR验证后，将其送至上海生工进行测序，所得序列提交NCBI，并和相关种属进行比对分析，构建系统进化树（Mega 5.0）[9]。

1.3堆肥实验方案

实验设计为单因素4水平3重复。将猪粪与秸秆粉按10：3混合[10]，分别装入各组通气发酵桶中，发酵桶示意图如图1。向其中三组桶中分别加入100、200、300 mL菌株AM2培养3 d的培养液，剩下一组加入200 mL的无菌Na2S2O3无机盐培养基作为对照，每5 d彻底翻堆一次，堆肥实验进行30 d。将温度传感器放入距堆肥反应器底15 cm处，设定每天记录一次肥堆温度。固体样品采样在堆肥实验开始以及每次翻堆后一天，按照五点采样法在堆体深约15 cm处采样，分别在牛肉膏培养基、马丁氏培养基和高氏一号培养基上通过平板计数法[11]测量细菌、真菌和放线菌数量。

图1　发酵桶示意图Figure 1 Composting reactor

1.4样品分析方法

气体样品使用0.5 L铝塑复合膜气体采样袋（大连海得科技有限公司），开启鼓风机在取样口充放气3次再取样。用装有火焰光度检测器（FPD）的气相色谱（Agilent 7890A气相色谱仪，毛细管色谱柱Agilent CP-Sil 5 CB for Sulfur Column 30 m×0.32 mm）检验样品中DMS含量，按照文献[12]操作。DMS减排率=（对照平均值-实验平均值）/对照平均值。

脲酶活性：苯酚-次氯酸钠比色法[13]，以1 g土壤中脲酶在37℃环境下24 h内分解尿素所产生的NH3-N的质量表示，单位为mg NH3-N·g-1·h-1。脱氢酶[14]：TTC法，在1 g土壤悬浊液中加入氯化三苯基四氮唑（TTC），24 h后测量所生成的三苯基甲臜（TF）的含量，单位为μg TF·g-1·h-1。过氧化氢酶[15]：紫外分光光度法，以1 g土壤在20 min内所分解的H2O2质量表示，单位为mg H2O2·g-1·20 min-1。蛋白酶：利用1 g土壤在1 min内水解酪蛋白所生成的酪氨酸质量表示蛋白酶的活力，生成1 μg酪氨酸为一个酶活单位，U·g-1[13]。纤维素酶[13]：在1 g土壤悬浊液中加入过量的羧甲基纤维素钠，50℃培养24 h，测量所生成的葡萄糖质量来表征纤维素酶酶活，单位为mg Glu·g-1·d-1。

利用SPSS20.0软件在95%的置信区间下对各组进行方差分析，检验各组数据间的差异性。数据整理与作图利用Excel软件。

2　结果与分析

2.1菌种分离与鉴定

从活性污泥中筛选出5株菌能够在Na2S2O3无机盐培养基上生长，分别标记为AM1、AM2、AM3、AM4 和AM5。经单因素方差分析得出，菌株AM2的发酵液中SO2-4含量平均值最大、标准差最小且与其他各菌差异明显（P＜0.05），如表2所示，表明AM2的氧化硫能力最强且稳定。将其选出进行后续研究，其最适生长条件为30℃、pH 7.0。

提取菌株AM2总基因组进行PCR扩增，PCR电泳结果如图2所示。凝胶电泳回收扩增序列，得到一段1468 bp长度的16S rDNA，所获序列提交Genbank进行BLAST。对BLAST结果进行分析，通过Mega 5.0软件构建系统发育树如图3，发现菌株AM2与Thiobacillus属中的模式种Thiobacillus neapolitanus CIP 104769（JN175334）同源性为100%。结合形态特征鉴定结果，最终将菌株AM2鉴定为那不勒斯硫杆菌（Thiobacillus neapolitanus）。

表2　培养3 d后SO2-4含量Table 2 SO2-4concentrations in compost after 3 days of culture

图2　菌株AM2的16S rDNA PCR扩增结果Figure 2 PCR amplification results of 16S rDNA in strain AM2

图3　菌株AM2系统进化树Figure 3 Neighbor-joining tree based on 16S rDNA sequences of strain AM2

2.2菌株AM2对DMS排放量的影响

DMS排放情况如图4所示。对照组与加菌各组的DMS释放量差异显著（P＜0.05）。在第5 d对照组DMS释放量开始大幅上升，说明在堆肥前5 d DMS就已经开始在堆体中大量积累，至第10 d对照组达到最大值16.3 mg·m-3。而接菌各组DMS的排放量在前5 d没有明显波动并在第5 d之后开始下降。在第8～15 d期间，100 mL组DMS释放量显著高于（P＜0.05）200 mL和300 mL组，但仍显著低于（P＜0.05）对照组；200 mL和300 mL组之间差异不明显（P＞0.05），但是300 mL组平均值更小。说明菌株AM2的添加对减少DMS的释放有明显的作用，就本实验而言，各接菌量之间差异并不明显，因此取接菌各组减排率的平均值。从堆肥反应的第8 d开始到第28 d，接菌各组的DMS气体平均减排率一直保持在60%以上。

图4　菌株AM2对堆肥过程中DMS排放量的影响Figure 4 Effect of strain AM2 on DMS emissions during composting process

2.3菌株AM2对可培养微生物数量的影响

可培养微生物数量变化见表3。细菌多为单细胞存在[16]、比表面积大、繁殖快，所以细菌在整个堆肥过程数量始终占有绝对优势。有研究认为真菌对高温耐性较低[17]，所以其数量最少。接菌各组的细菌数和真菌数的高峰期均提前了5 d，且保持时间较对照组也有所延长。嗜热放线菌在高温肥堆中活性较高[18]，所以数量高于真菌。接菌各组和对照组放线菌数量都在第16 d达到最大值。接菌各组可培养微生物数量之间差异不显著（P＞0.05），但均显著高于对照组（P＜0.05）。

表3　可培养微生物数量变化Table 3 Changes in population of culturable microbes

2.4菌株AM2对堆肥温度的影响

图5为接菌各组与对照组在堆肥反应器中的温度及环境温度变化情况。在每次翻堆之后温度都有一次明显的上升，且接菌各组能达到更高的最大值。接菌各组之间差异不显著（P＞0.05），但整个堆肥过程中对照组堆体温度明显小于（P＜0.05）接菌的三组。堆体温度主要来自于微生物新陈代谢的生物热，较高的堆体温度表明生物的活性较高[19]，说明AM2能够提高堆体的生物活性。

2.5菌株AM2对堆肥酶活性的影响

2.5.1脱氢酶

各组脱氢酶酶活随发酵时间变化趋势如图6所示。接菌的三组和对照组变化趋势有明显的差异（P＜0.05），但接菌各组之间差异不显著（P＞0.05），100、200、300 mL组脱氢酶酶活第6 d时迅速上升并在第11 d达到最高值，分别是4.798、5.229、5.053 μg TF· g-1·h-1。第6 d脱氢酶酶活的上升可能与第5 d翻堆使产脱氢酶的微生物数量回升有关，并且脱氢酶酶活的升高与DMS释放大量减少出现在同一时间点上，推测AM2氧化DMS时需要脱氢酶的参与。对照组脱氢酶酶活则在第16 d达到最大值3.762 μg TF·g-1·h-1。在第16 d之后各组都开始缓慢下降。

图5　菌株AM2对堆肥温度的影响Figure 5 Effect of strain AM2 on temperature during composting process

图6　脱氢酶酶活变化趋势Figure 6 Changes of dehydrogenase activity during composting process

2.5.2过氧化氢酶

各组过氧化氢酶酶活随时间的变化如图7所示。在第6 d下降到最低点，100、200、300 mL组和对照组分别为30.0、29.6、28.7、33.8 mg H2O2·g-1·20 min-1。在堆体高温期时实验各组有更高的温度，所以过氧化氢酶酶活要小于对照组，在第16 d各组的过氧化氢酶酶活均达到最大值，100、200、300 mL组和对照组分别为52.1、53.4、54.3、45.5 mg H2O2·g-1·20 min-1。除在第6 d对照组要明显高于（P＜0.05）接菌的三组之外，其余时间接菌组都要明显高于（P＜0.05）对照组，而接菌各组之间没有明显的差异（P＞0.05）。

图7　过氧化氢酶酶活变化趋势Figure 7 Changes of catalase activity during composting process

2.5.3脲酶

各组脲酶酶活整体趋势如图8所示，呈现先下降后上升最后下降并趋于平稳。脲酶酶活的最小值和最大值分别出现在第6 d和第16 d，100、200、300 mL组和对照组的最小值分别是0.351、0.362、0.332、0.412 mg NH3-N·g-1·h-1，最大值分别是0.683、0.718、0.701、0.573 mg NH3-N·g-1·h-1。至第11 d时接菌的三组脲酶酶活已经反超对照组，并在之后的过程中一直明显高于（P＜0.05）对照组，接菌各组之间没有明显的差异（P＞0.05）。

图8　脲酶酶活变化趋势Figure 8 Changes of urease activity during composting process

2.5.4蛋白酶

各组蛋白酶酶活的变化趋势如图9所示。第6 d是各组蛋白酶酶活的最低点，各组之间没有明显差异（P＞0.05）。第11 d之后接菌的三组开始显著高于（P＜0.05）对照组，但接菌各组之间差异不显著（P＞0.05）。酶活最大值出现在第16 d，100、200、300 mL组和对照组分别是23.8、24.3、23.6、18.8 U·g-1。

图9　蛋白酶酶活变化趋势Figure 9 Changes of protease activity during composting process

2.5.5纤维素酶

各组纤维素酶酶活的变化趋势如图10所示。在第6 d各组均下降至最小值，但对照组显著高于接菌各组。在第16 d各组均达到最大值，100、200、300 mL组和对照组分别为7.6、7.9、8.1、6.9 mg Glu·g-1·d-1，接菌各组之间没有差异（P＞0.05），但均显著高于（P＜0.05）对照组。在第21 d之后接菌各组与对照组之间差异不显著（P＞0.05）。

图10　纤维素酶酶活变化趋势Figure 10 Changes of cellulose enzyme activity during composting process

3　讨论

二甲基硫醚（DMS）的释放与蛋白质的分解密切相关[20]，不添加外源微生物的对照组会在第一次翻堆后达到DMS的释放高峰，而添加AM2的三个实验组在翻堆之后DMS的释放量只有小幅的增加。这说明DMS气体主要积累于堆体内部，翻堆使之大量外泄，与Dai等[1]的实验结果相符。因为堆体小且添加了秸秆粉使物料堆的通气性能满足AM2的生长需求，DMS在添加AM2的各组堆体中被氧化，所以在翻堆时没有大量的DMS外泄。在第6 d时实验各组的脱氢酶酶活要显著高于对照组（P＜0.05），同时实验各组的DMS释放量也要显著低于对照组（P＜0.05）。脱氢酶是氧化酶类，而那不勒斯硫杆菌的硫代谢特性是将低价硫氧化成硫单质或SO2-4[21]，据此推测脱氢酶有可能参与到DMS的转化利用中。

发酵时堆体温度能在一定程度上反映微生物活动状况，温度越高说明微生物活性越高。实验各组在试验中堆体温度均显著高于对照组（P＜0.05），同时实验各组的脱氢酶在实验前期就显著高于对照组，推测外源微生物AM2的加入使脱氢酶酶活升高，一方面参与DMS的转化，另一方面参与其他有机物的分解而产生更多生物热。实验各组均有13 d温度达到50℃以上，而对照组只有9 d，虽然都达到无害化标准[22]，但实验组的高温保持得更长，可将无害化进行得更彻底，而且其中有12 d在50～60℃之间，这是大多数菌适宜的发酵温度[23]，所以实验组的高温发酵更有助于肥料腐熟。

微生物是肥料发酵的主体，在第3～4 d堆体经历了第一次高温，在此期间有大部分非耐热微生物被杀死，从而选择出耐热菌，此时微生物总数迅速下降。在第5 d时对堆体的充分翻堆使温度迅速下降，含氧量也迅速增加，此时为微生物数量的回升提供了一次短暂的机会，相应地细菌数量在第6 d时较实验开始有所增加。因为AM2有效减少了有抑菌作用[3]的DMS的产生，所以实验各组的细菌数一直显著高于对照组（P＜0.05），说明AM2的添加促进了细菌数量的增加。真菌的数量在第6 d都有所下降，说明第5 d的翻堆没有使真菌恢复至开始水平，同时对照组在第6 d处于DMS释放的高峰期，其真菌数量受温度和DMS的双重制约，因而显著低于（P＜0.05）接菌的各组，直到度过高温期和DMS释放高峰期才在第16 d达到数量的最高值，而且仍然低于同期的接菌各组。各组的放线菌数量差异不显著（P＞0.05），说明放线菌对DMS有一定抗性。但是由于细菌和真菌的差异导致接菌的各组堆体温度、酶活性、菌体活性等理化生指标都优于对照组，致使放线菌数量在第6～21 d略高于对照组。

堆肥中的酶活性决定着微生物分解有机物的能力[24]，所以堆肥过程中酶活性的变化趋势可以作为堆肥进程的指向性指标。有机物的降解多为脱氢氧化过程，脱氢酶和过氧化氢酶都是氧化酶类，可以用来表征微生物降解有机物的活性[25]。在堆肥初期脱氢酶酶活有所上升，而此时的DMS释放量下降明显，可能与添加的菌株AM2氧化DMS有关。过氧化氢酶的下降与堆体的高温有关，高温抑制了产过氧化氢酶微生物和酶本身的活性[26]。脲酶活性先降后升，与谭小琴等[25]的结果相符，脲酶酶活与微生物量呈正相关[27]，脲酶酶活在最低时微生物量也处于较低水平，而到第16 d左右，三大类微生物含量和脲酶酶活均在最高时期，并且接菌各组都要显著高于对照组，说明接入的AM2能够促进微生物生长。蛋白酶酶活在第11～21 d活性最大，可能与此时蛋白质快速分解有关。纤维素酶对堆体中C/N有很大的影响，可能由于实验各组有较高的堆体温度，在实验前期纤维素酶酶活要低于对照组，而只在第16 d时高于对照组，说明AM2对纤维素酶影响不大。

4　结论

从活性污泥中得到一株能够在Na2S2O3无机盐培养基上生长的菌株AM2，通过对其16S rDNA序列分析，确定为那不勒斯硫杆菌（Thiobacillus neapolitanus）。通过堆肥实验证实AM2能够有效减少DMS的释放量，增强有关酶活性，促进肥料的腐熟。

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Isolation and identification of a DMS-oxidizing bacterium and its impacts on swine manure composting

GUO Yan-zhao1, FU Rui-min1,2, XUE Ting-ting1, GU Ya-nan1, MA Wei-chao1, CHEN Wu-Ling1*
（1.The College of Life Sciences, Northwest University, Xi'an 710069, China; 2.Department of Life Science, Henan Institute of Education, Zhengzhou 450046, China）

Abstract：A DMS-oxidizing bacterial strain AM2 was isolated from activated sludge by using streak plate method, and was identified as Thiobacillus neapolitanus. Its optimum temperature and pH were respectively 30℃and 7.0. Impact of the strain AM2 on swine and straw mixture composting was examined by monitoring DMS outputs, temperature, culturable microorganism population and enzyme activity in the compost. Compared with control, inoculation with AM2 not only significantly（P＜0.05）decreased DMS outputs with over 60% reduction for 20 days during 30-day experimental period, but also significantly（P＜0.05）promoted culturable microbe population. Compost temperature maintained above 50℃for 13 days during the experimental period. Activities of dehydrogenase, urease, catalase, protease and cellulose were significantly（P＜0.05）higher in DMS-inoculated than in control groups. To sum up, the strain AM2 can effectively reduce DMS emissions during composting process and promote compost maturity.

Keywords：dimethyl sulfide; Thiobacillus neapolitanus; 16S rDNA; swine manure composting; enzyme activity

*通信作者：陈五岭E-mail：wulingchen@yeah.net

作者简介：郭彦钊（1989—），男，陕西西安人，在读硕士，从事农业及环境微生物学研究。E-mail：guoyanzhao1204@163.com

基金项目：农业部科技成果与转化项目（2012GB2 G000451.）；陕西省重大科技创新项目（2009ZKC04-16）

收稿日期：2015-07-28

中图分类号：X172

文献标志码：A

文章编号：1672-2043（2016）02-0372-08

doi:10.11654/jaes.2016.02.023