土霉素废渣对典型植物发芽影响研究*

田智宇，曹卫宇，邹晓岱

(上海化工研究院 上海 200062)

土霉素废渣对典型植物发芽影响研究*

田智宇，曹卫宇，邹晓岱

(上海化工研究院 上海 200062)

为了解土霉素废渣对土壤中种子发芽率的影响以及不同生长期的植物对土霉素耐受能力的差异，以土霉素废渣、土霉素碱溶液和黄瓜种子为试验材料，以水溶液和土壤为介质，试验研究了土霉素碱溶液和土霉素废渣中的土霉素(污染水平为0～4 000 mg/kg)对黄瓜种子发芽率和幼苗期生长情况的影响。试验结果表明：当土霉素污染水平为25～50 mg/kg时，对黄瓜种子发芽率和幼苗期生长均有促进作用；当土霉素污染水平超过100 mg/kg时，无论是水培还是土培条件下，均对黄瓜幼苗期地上部茎高及生物量产生显著的影响；不同处理方式对黄瓜种子发芽率影响的大小顺序为土霉素废渣+土壤>土霉素碱溶液+水>土霉素碱溶液+土壤，对黄瓜幼苗期生长影响的大小顺序为土霉素碱溶液+水>土霉素废渣+土壤>土霉素碱溶液+土壤；抗生素在土壤中的生态毒性效应明显低于水溶液；黄瓜生长在前期比后期更易受土霉素废渣污染的毒害。

土霉素废渣 黄瓜 发芽率

在土霉素生产过程中，过滤产生的废渣中含有少量的土霉素(4 000～8 000 mg/kg)，并含有各种氨基酸、粗蛋白质及多种微量元素[1- 2]。为了保证土霉素废渣用作土壤调理剂时的安全性，目前的处置技术能将废渣中的土霉素含量降解至10～30 mg/kg，但残留的微量土霉素和降解产物对环境的危害程度如何，由于缺乏相关的研究资料，目前还不能准确评估。土霉素是抗生素中具有代表性的四环素类，其对植物的一系列理化性质以及土壤中抗生素的环境行为均有显著的影响，因此，研究植物-抗生素的相互作用对于毒理学和植物学具有重要的现实意义。

进入土壤中的抗生素被植物吸收，从而影响植物正常的生理代谢，近年来一些专家、学者认为土霉素是一种促进型植物激素而引起了业内的广泛关注。在自然环境中，土霉素在土壤中的含量极低，在深5 cm土壤中的土霉素含量仅为0.16～0.27 mg/kg[3]，故已有的研究都要设定一定浓度范围的初始土霉素营养液，如1～10 mg/kg范围内对生菜生长的影响[4]、0～30 mg/kg范围内对青菜生长的影响[5]以及高达0～25 000 mg/kg范围内对小麦生长的影响[6]。但这些研究主要针对在水溶液和土壤介质体系中的土霉素，目前有关抗生素废渣对土壤中植物种子的毒性影响尚少见报道。

本研究以黄瓜为受试作物，研究半自然条件下土霉素碱溶液和土霉素废渣在水溶液和土壤(褐土)介质中对黄瓜种子发芽和幼苗期生长的影响，通过研究植物种子发芽受抑制的程度，为今后土霉素废渣对动物、微生物的毒性乃至人体健康毒理研究均具有启示探索作用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试黄瓜：品种为天津新四号，购自东亚种子公司，选择籽粒饱满、大小和色泽一致的种子进行试验。

供试土壤：采自内蒙古赤峰市，为草原盐碱土，采样深度0～3 m，过150m(100目)筛，其含水质量分数为8.0%，pH为6.13，经检测含有少量土霉素残留(38.6 μg/kg)。

供试土霉素废渣：由内蒙古格林特制药有限公司提供，含土霉素约4 000 mg/kg；降解后的土霉素废渣含土霉素约10 mg/kg，由上海化工研究院化肥所提供。

供试土霉素碱溶液：由内蒙古格林特制药有限公司提供，纯度95%(质量分数)以上。

10 000 mg/kg土霉素储备液：将1 g土霉素碱溶液溶于500 mL Tris- HCl溶液(pH=7)中，然后用铝箔包裹并置于冰箱中保存，使用时需将其pH调节至6～7才能进行后续试验。

1.2 土霉素碱溶液发芽试验

水培试验：在Φ9 cm的玻璃培养皿中铺一层滤纸，将消毒后的20粒黄瓜种子均匀地置于培养皿中，然后加入不同浓度的10 mL土霉素碱溶液，其中土霉素最高浓度为4 000 mg/kg(全部试验均采用同一水平梯度浓度)，置于25 ℃人工气候箱中培养20 d；对照中加入10 mL去离子水；所有处理3次重复。对照种子发芽率大于90%、胚芽和胚根长度>2 mm时，认为是种子正常发芽；当对照根长达20 mm时，培养结束，测定各处理的种子发芽率、幼苗株高平均值及标准偏差。

土培试验：称取300 g土壤于塑料培养盒中，将不同浓度土霉素碱溶液均匀地喷洒于土壤表层(对照喷洒去离子水)后混合搅拌均匀染毒，调节土壤含水质量分数至约25%，每个处理播20粒种子，置于25 ℃人工气候箱中培养20 d，每个处理进行3次重复。当培养种子达到正常发芽标准时，测定各处理的种子发芽率、幼苗株高等指标。

笔者选取了2015年～2016年度授予学位的30本博士论文为例，说明留学生博士论文纸本封皮信息与教育部授予名单信息存在的差异。该30本博士论文分别来自15所不同的授予单位，15所授予单位分别来自中国的东北、华北、西北、东南、西南地区。30本博士论文作者分别来自巴基斯坦、老挝、新加坡、韩国、越南、苏丹、伊拉克等十几个国家。30本博士论文专业各不相同。

1.3 土霉素废渣发芽试验

称取150 g土壤于塑料培养盒中，将不同浓度的土霉素废渣与土壤按质量比1∶1混合搅拌均匀染毒，对照不加入废渣，然后放置24 h老化，在与上述试验相同温度条件下进行种子的培养试验，每个处理播20粒种子并进行3次重复。培养20 d后，当培养种子达到正常发芽标准时，测定各处理的种子发芽率、幼苗株高等指标。

1.4 数据处理

采用Excel 2010计算3次重复所得数据的平均值及标准偏差，对数据进行单因素方差分析，差异显著性水平为p<0.05。

2 试验结果

2.1 促进黄瓜发芽的最佳土霉素浓度的确定

第1阶段(无论是土霉素废渣还是土霉素碱溶液中土霉素浓度范围500～4 000 mg/kg)的毒性试验结果表明，土霉素废渣和土霉素碱溶液加入土壤中，抑制黄瓜种子发芽的土霉素浓度极限值均在4 000 mg/kg左右，而土霉素碱溶液加入水中影响黄瓜种子发芽的极限值在500 mg/kg左右。为此，第2阶段的试验缩小土霉素浓度范围，在0～500 mg/kg内以几何级数为间隔进行，从而确定促进黄瓜种子发芽的最佳土霉素剂量。

本试验体系中含有土霉素碱溶液和土霉素废渣，为使所测结果能较客观地反映黄瓜种子发芽生长，必须采用水培和土培试验进行对照。

在土霉素浓度0～4 000 mg/kg范围内进行的试验表明：①土霉素是一种重要的植物激素，能促进种子和其他休眠器官的萌发，促进代谢反应，刺激植物生长，但与其浓度密切相关。从试验结果得知，无论是单一土霉素碱溶液还是土霉素废渣+土壤混合物，剂量范围在25～50 mg/kg时，对黄瓜种子发芽率、幼芽早期生长发育均有显著的促进作用。②土霉素碱溶液添加至土壤和水中，使得植物种子发芽率与对照相比也存在差异，水培对种子发芽率的影响远大于土培。不同浓度土霉素对黄瓜种子发芽率的影响如图1所示。

图1 不同浓度土霉素对黄瓜种子发芽率的影响

试验表明，土霉素各处理都能不同程度地提高黄瓜种子发芽率，但发芽率均存在差异。由图1可知：土霉素碱溶液和土霉素废渣分别加入土壤，以上2种处理的对照组的土霉素浓度为0 mg/kg，其发芽率分别为86.3%和38.3%；在土霉素浓度为25 mg/kg时，发芽率均达到最高点，分别为100.0%和76.7%，其中低浓度土霉素废渣对黄瓜种子发芽率的提高最为显著，提高38.4%；继续升高土霉素浓度，发芽率不断下降，但仍高于对照；当废渣的土霉素剂量超过100 mg/kg后，对黄瓜种子发芽产生显著影响，与对照相比，几乎无法发芽。

不同浓度土霉素碱溶液在水中抑制种子发芽的作用均大于在土壤中，且土霉素浓度越高抑制作用越明显。种子在土霉素碱溶液+水中培养，纯水(对照)中种子发芽率保持100%，随着土霉素碱溶液浓度不断提高，当达500 mg/kg时，种子发芽率明显下降；水中土霉素污染水平高于750 mg/kg时，种子几乎不能发芽，而土壤中土霉素碱溶液污染水平直至4 000 mg/kg仍能发芽。

2.3 土霉素碱溶液和土霉素废渣对黄瓜株高和生物量的影响

试验表明，3个处理的土霉素污染对黄瓜株高和生物量的影响有较大差异，其中土霉素碱溶液+土壤的影响最为明显，如图2所示。

图2 不同浓度土霉素对黄瓜株高和生物量的影响

由图2可知：与土霉素浓度为0 mg/kg(对照)相比，在土霉素碱溶液中的土霉素浓度为25 mg/kg的土壤上生长的黄瓜株高和生物量分别提高了13.7%和3.1%；在相同的污染水平下，土霉素碱溶液+水和土霉素废渣+土壤的黄瓜株高则分别比对照下降了83.7%和50.5%，生物量也分别比对照下降了58.9%和33.3%；当土霉素碱溶液中土霉素剂量达到50 mg/kg时，土霉素碱溶液+水处理的株高和生物量与25 mg/kg水平相比提高了62.5%和28.0%，土霉素废渣处理的株高和生物量提高了16.1%和9.5%；随着土霉素污染水平的继续提高，3个处理的株高和生物量均呈现下降趋势。试验结果表明：无论在何种环境中，种子生长前期对土壤抗生素的污染抵抗能力较弱，土霉素溶液会直接对种子发芽造成影响，使得株高和生物量一直低于对照；土霉素碱溶液加入土壤中的影响小于其他2个处理。

3 讨论

3.1 影响发芽率的主要因素

种子发芽试验和早期幼芽生长发育试验是毒理学常用的试验方法，具有快速、便捷等优点，被众多的学者用作研究污染胁迫下的植物发芽、生长以及芽长等指标以综合评价该污染物的毒性[7- 8]。本试验研究发现，土霉素废渣或土霉素碱溶液中的土霉素浓度<25 mg/kg时，黄瓜种子发芽率与对照相比均无显著差异。一方面是由于抗生素等新型污染物的毒性不如工业化学品那样剧烈，另一方面种皮对种子的保护作用不可忽略，抗生素很可能被吸附在种皮上而并不会对种子根部的生长发育产生剧烈影响，即种皮起到阻挡种子胚芽与外界环境直接接触的作用，使胚芽免受污染物的直接侵害[9]。值得注意的是，目前确定的种子发芽标准是胚根从种孔中突破种皮，向下生长形成主根，但这种生长并不一定是由细胞分裂产生的，而可能仅是简单的细胞生长[10]。这就意味着虽然从表面上看种子正常发芽伸出，但并不能说明污染物的胁迫对它们体内的细胞没有毒性效应。随着抗生素浓度的增加(土霉素浓度≥100 mg/kg)，抗生素对种子发芽率产生了显著的抑制作用，说明此时抗生素已对种子的萌发产生毒性效应。

黄瓜的芽生长抑制率随抗生素浓度的增加呈上升趋势。浓度相同时，土霉素碱溶液在土壤中对黄瓜芽生长抑制效应明显低于在水溶液中，表明土壤介质对抗生素污染有缓冲作用。其原因与此类抗生素被土壤吸附且不易解吸有关，从而降低了其生物有效性和向土壤水溶液中的释放。

3.2 影响株高和生物量的主要因素

试验结果表明：土霉素浓度在25～50 mg/kg时，对黄瓜发芽生长具有显著的促进作用，这是由于低浓度的抗生素对植物生长具有一定的促进作用[11]；但当抗生素浓度超出黄瓜种子所能耐受的范围，黄瓜的芽生长又逐渐出现抑制效应。

在土培条件下，土霉素碱溶液处理的黄瓜幼芽生长和生物量均高于废渣处理，表明废渣对植物的缓冲强度高于土霉素碱溶液。其原因可能是土霉素废渣内残留的微量土霉素和降解物施入土壤后，导致幼芽生长受阻；也可能是污染物抑制了土壤中微生物的活性，使土壤中营养物质转化受阻，影响作物根系对营养物质的吸收，导致作物根尖细胞有丝分裂数明显减少，分裂速度减慢，从而导致幼芽生长受抑制。因此，很容易理解土霉素废渣+土壤最能影响种子发芽，而且说明土霉素废渣+土壤复合体有其特殊性，不是这两者简单的加和作用。研究发现，所用土壤对土霉素的生物有效性具有较强的降低作用，但有待于结合其在土壤中的吸附、解吸、生物有效性、形态分析等作出进一步解释。

4 结语

(1)在本试验研究的土霉素污染范围(0～4 000 mg/kg)内，低浓度土霉素对种子发芽率影响不明显，但高浓度(100 mg/kg以上)的土霉素污染对黄瓜幼苗期地上部茎高及生物量产生显著影响。研究表明，土霉素废渣对黄瓜生长前期的影响比后期大。有关土霉素污染对黄瓜生长影响的机理还有待进一步深入研究。

(2)抗生素在土壤中的生态毒性效应明显低于水溶液，这可能与土壤对抗生素有很强的缓冲作用有关。

(3)3种处理方式对于黄瓜种子发芽率影响的大小顺序为土霉素废渣+土壤>土霉素碱溶液+水>土霉素碱溶液+土壤，对于黄瓜幼苗期生长影响的大小顺序为土霉素碱溶液+水>土霉素废渣+土壤>土霉素碱溶液+土壤。发芽率可以作为诊断土霉素废渣对土壤毒性的敏感指标，反映土壤被土霉素污染的状况。

[1] 许建宁，李忠生，罗玉姝，等.土霉素药渣作为饲料蛋白的安全性评价[J].中国饲料，1995(12)：16- 19.

[2] 孙宏丽，刘智勤，徐红欣，等.去除效价的土霉素药渣亚慢性毒性试验[J].中国畜牧兽医，2010(1)：164- 165.

[3] 赵玲，刘玉芳，尹平河，等.土霉素在土壤中的垂直迁移及其影响因素研究[J].农业环境科学学报，2012(8)：1519- 1524.

[4] 崔馨，乔显亮，韩成伟，等.生菜对土霉素的吸收及其植物毒性[J].农业环境科学学报，2008(3)：1038- 1042.

[5] 徐秋桐，鲍陈燕，顾国平，等.土霉素对不同生长期青菜生长的影响及其在青菜地上部分的积累[J].中国农学通报，2014(28)：189- 193.

[6] 鲍艳宇，周启星，谢秀杰.四环素类抗生素对小麦种子芽与根伸长的影响[J].中国环境科学，2008(6)：566- 570.

[7] LIU W, YANG Y S, ZHOU Q, et al. Impact assessment of cadmium contamination on rice (Oryza sativa L.) seedlings at molecular and population levels using multiple biomarkers[J]. Chemosphere，2007(6)：1155- 1163.

[8] 李悦，谢诗，陈忠林，等.锌、苯并[a]芘及其复合胁迫对小麦幼苗生长及抗氧化酶的影响[J].生态学杂志，2013(2)：358- 362.

[10] CHON S U, NELSON C J, COUTTS J H. Osmotic and autotoxic effects of leaf extracts on germination and seedling growth alfalfa[J]. Agronomy Journal，2004(6)：1673- 1679.

[11] 林琳，安婧，周启星.土壤四环素污染对小白菜幼苗生长发育的生态毒性[J].环境科学，2011(8)：2430- 2435.

Study of Effect of Oxytetracycline Residue on Germination of Typical Plants

TIAN Zhiyu, CAO Weiyu, ZOU Xiaodai

(Shanghai Research Institute of Chemical Industry Shanghai 200062)

In order to understand the effect of oxytetracycline waste residue on germination rate of seed in soil and the difference in endurance capacity of plants in different growth period, with oxytetracycline residue, oxytetracycline alkali solution and cucumber seed used as experimental materials, and aqueous solution and soil used as media, a study is carried out of the effect of oxytetracycline in oxytetracycline residue and in oxytetracycline alkali solution (pollution level is 0～4 000 mg/kg) on seed germination rate and growth at seedling stage. Experimental results show when pollution level is 25～50 mg/kg, oxytetracycline has promoting effect on both seed germination rate and seeding stage growth of cucumber; when pollution level is above 100 mg/kg, oxytetracycline has significant influence on cucumber shoot height at seeding stage and biomass, whether it is in hydroponic condition or is in soil culture condition; the influence extent of different treatments on cucumber seed germination rate is in the order of oxytetracycline residue + soil > oxytetracycline alkali solution + water > oxytetracycline alkali solution + soil; the influence level on cucumber seeding stage growth is in the order of oxytetracycline alkali solution + water > oxytetracycline residue + soil > oxytetracycline alkali solution + soil; the ecotoxicological effects of antibiotic in soil is obviously lower than that in aqueous solution; and cucumber is easily poisoned by oxytetracycline residue in early growth stage than in later growth stage.

oxytetracycline residue cucumber germination rate

上海张江国家自主创新示范区专项发展资金重点项目(201505- PT- C104- 025)。 作者简介：田智宇(1990—)，男，研究方向为抗生素废渣处理；tian199047@163.com。

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1006- 7779(2016)06- 0082- 05

2016- 10- 18)