骨质疏松症抑制人间充质干细胞的成骨分化研究

谢勇

（黑龙江省佳木斯市中心医院，黑龙江佳木斯154002）



骨质疏松症抑制人间充质干细胞的成骨分化研究

谢勇

（黑龙江省佳木斯市中心医院，黑龙江佳木斯154002）

摘要：为探讨骨质疏松症对人骨髓间充质干细胞（hMSC）的成骨分化抑制作用，选取，抽取骨髓血样，取原代干细胞，培养增殖至P4代，进行实验分组和成骨诱导，随后测定碱性磷酸酶含量，判断成骨分化活性。实验培养期间，观察干细胞形态学特征。碱性磷酸酶含量检测：随培养时间延长，A组和B组碱性磷酸酶含量均出现上升趋势。A组和B组中，使用成骨诱导液的1组，碱性磷酸酶含量更高，显著高于空白对照组，差异p＜0.01。A组和B组中使用成骨诱导液组比较，碱性磷酸酶含量均存在显著差异p＜0.01。A组和B组中空白对照组比较，碱性磷酸酶含量均存在显著差异，A组显著低于B组，差异p＜0.01。说明骨质疏松症患者人骨髓间充质干细胞（hMSC）存在成骨分化抑制作用，给予成骨诱导液后，可促进成骨分化。

关键词：骨质疏松症；人骨髓间充质干细胞；成骨分化

我国老年性骨质疏松症发病率随人口老龄化趋势发展逐渐升高，成为老年疾病防治的重点。近年来，hMSC体外培养研究发现，可诱导成骨、成软骨及成脂肪分化，而成骨分化对于改善老年性骨质疏松症骨量和骨微细结构具有重要作用［1］。为此，本次研究选取2013年5月——2015年5月本院收治的5例骨质疏松症患者作为A组，另选择非骨质疏松症患者5例作为B组，对骨质疏松症对hMSC成骨分化的抑制作用进行了对比分析，现报道如下。

1材料与方法

1.1一般资料

选取2013年5月——2015年5月本院收治的5例骨质疏松症患者作为A组，另选择非骨质疏松症患者5例作为B组。A组，男2例，女3例，年龄49～71岁，平均年龄（60.25±11.33）岁；B组，男2例，女3例，年龄49～72岁，平均年龄（60.68±11.63）岁。两组患者在年龄、性别等一般资料方面，无比较差异p＞0.05，认为有可比性。两组患者均签署知情同意书，本研究经院伦理委员会批准。

1.2实验方法

1.2.1分离培养

两组患者均在本院行脊柱手术治疗，术中抽取腰椎骨髓血20mL。两组患者骨髓血样均常规离心，取原代干细胞，吹打悬浮细胞，置于细胞培养箱中培养。培养14d后，使用胰蛋白酶收集细胞，并接种记录为P1代，然后继续按照上述方法进行传代。

1.2.2实验分组与成骨诱导

将A组和B组两组患者的hMSC均扩增至P4代，按相同密度接种至96孔培养板（1.33×104／cm2）。两组成骨诱导液成分相同：地塞米松、二磷酸抗坏血酸、β－甘油磷酸、BSL－DMEM培养基。A组均分为2组，其中1组作为对照组（空白），使用10%FBS L－DMEM培养液；另1组使用上述成骨诱导液。B组分组方法同A组。两组96孔板细胞增殖，用于碱性磷酸酶含量检测。

1.2.3人间充质干细胞碱性磷酸酶（ALP）含量检测

将人骨髓间充质干细胞接种于96孔板上，成骨诱导开始后，记录第3d、7d、14d细胞增殖活性碱性磷酸酶含量。采用酶联免疫检测仪（Thermo354）计算各孔吸光度值，然后使用PBS、ALP缓冲液、对磷酸对硝基苯酯，常规避光孵育，然后测量OD值。

1.3统计学方法

采用SPSS20. 0统计学软件分析研究数据，计量资料采用t检验；计数资料采用χ2检验，p<0.05认为差异显著，有统计学意义。

2　结果

2.1形态学特征

骨髓间充质干细胞混悬液接种初始：干细胞呈圆形，可见悬浮的红细胞，同含有细胞碎片，未见细胞贴壁。

原代干细胞接种完成后，细胞形态为小圆形、多角形和梭形，接种3～5h开始出现细胞贴壁，仅为少量贴壁，呈集落样生长，此状态持续约48h，后可见少量细胞贴壁；细胞接种3d后，细胞形态较为均一，均呈现长梭型，吸弃未贴壁细胞，对培养液进行更换（首次）。

培养接种7d后，干细胞仍为形态均一的长梭型，呈集落样生长。

培养至14d时，干细胞呈漩涡样生长，融合达到70%～90%时，出现纤维细胞样形态。

2.2人间充质干细胞碱性磷酸酶含量检测

体外培养3d、4d、7d，随培养时间延长，A组和B组碱性磷酸酶含量均出现上升趋势。A组中，使用成骨诱导液的1组，碱性磷酸酶含量更高，显著高于空白对照组，差异p＜0.01（χ2＝29.256，P＝0.002），认为有统计学意义。B组中，使用成骨诱导液的1组，碱性磷酸酶含量更高，显著高于空白对照组，差异，认为有统计学意义。

A组和B组中使用成骨诱导液组比较，碱性磷酸酶含量均存在显著差异，A组显著低于B组，差异，认为有统计学意义。

A组和B组中空白对照组比较，碱性磷酸酶含量均存在显著差异：A组显著低于B组，差异，有统计学意义，如图1所示：

图1两组hMSC细胞碱性磷酸酶（ALP）活力检测Fig.1 Activity detection ofALP of two group hMSC cells

3　讨论

目前，骨质疏松症治疗方法较多，但是总体效果不够理想，尤其在骨愈合与骨再生方面治疗效果较差。hMSC与成骨分化存在密切联系，而成骨分化骨再生及愈合的基础。故本次研究中对骨质疏松症患者的hMSC与成骨分化进行了对比，研究结果显示，骨质疏松症患者hMSC碱性磷酸酶含量较非骨质疏松者下降。本次研究还发现，骨质疏松症患者hMSC使用成骨诱导液后，碱性磷酸酶含量升高。

碱性磷酸酶是hMSC细胞早期成骨分化指标，可于早期促进hMSC向成骨细胞分化，而本次研究发现骨质疏松症患者hMSC细胞中碱性磷酸酶含量下降，对于成骨细胞分化不利，提示发生了抑制作用。此外，通过成骨诱导液可提高碱性磷酸酶含量，从而促进成骨分化。国外相关临床研究认为，骨质疏松患者hMSC培养液中碱性磷酸酶含量略低于非骨质疏松患者，但差异不显著，与本次研究存在差异，分析其原因可能与时间、诱导液剂量相关，应进一步深入研究［2］。

骨质疏松症患者人骨髓间充质干细胞（hMSC）存在成骨分化抑制作用，给予成骨诱导液后，可促进成骨分化［3］。

参考文献：

［1］代学俊，岑蔼儿，张春梅，等.骨质疏松症抑制人间充质干细胞的成骨分化［J］.中山大学学报(医学科学版)，2014，11（05）:723- 729.

［2］杨楠. miR- 21及其靶基因Sprouty1调控人骨髓间充质干细胞成骨分化的机制研究［D］.西安：第四军医大学，2012.

［3］董海，周之德，戴力扬.骨髓间充质干细胞成骨定向分化的研究进展［J］.创伤外科杂志，2012，（05）：138- 139.

Research on Inhibition of Osteoporosis on hMSCOsteogenic Differentiation

XIE Yong
(JiamusiCentral Hospital of Heilongjiang Province, Jiamusi 154002, China)

Abstract:To investigate inhibition of osteoporosis on hMSC osteogenic differentiation, this paper selected two group patients. Extractingmarrow blood and primary stem cells of two groups, make cell proliferation to P4 generation, take osteogenic induction, and then mesure the content of alkaline phosphatase to determine the activity of osteogenic differentiation. Boththe alkaline phosphatase content of group A and group Bincreased. Alkaline phosphatase content of the group with the use of osteogenic induction solution was significantly higher than the control group, the difference was p< 0.01. Alkaline phosphatase content of group A and group B used osteogenic induction solution were significantly different p<0.01. Alkaline phosphatase levels were significantly different p<0.01 in the control group of group A and group B, and group A was significantly lower than group B. It indicated thatinhibition of osteoporosis on hMSC osteogenic differentiation, after given osteogenic induction liquid can promote osteogenic differentiation.

Key words:Osteoporosis; hMSC; Osteogenesis differentiation

作者简介：谢勇（1979-），男，黑龙江佳木斯人，主治医师，硕士研究生，从事骨外科工作。

收稿日期：2015- 12- 26

中图分类号：R580

文献标志码：A

文章编号：1674-8646（2016）03-0016-02