长江中下游三所城市143例71型肠道病毒的基因特征分析

陈谨+程险峰+江炳福+詹圣伟+朱明+郑锦绣+陈道利

[摘要] 目的 了解长江中下游三城市肠道病毒71型（EV71）基因型的分布状况。方法 利用逆转录半巢式PCR的方法检测三所城市143份临床诊断为手足口病患儿的血清和咽拭子标本。 结果 143份标本中检测到阳性EV71 RNA33份（23%）；经过测序证实33份标本均为EV71 C4型。 结论 三所城市的手足口病主要由C型 EV71病毒引起。不同城市间EV71病毒存在一定的变异。

[关键词] EV71；RT-PCR；手足口病；基因型

[中图分类号] R373[文献标识码] B[文章编号] 1673-9701（2014）19-0076-03

The analysis of genic characteristics of 143 cases of enterovirus 71 in 3 cities of the middle and lower reaches of Changjiang River

CHEN Jin1 CHENG Xianfeng1 JIANG Bingfu2 ZHAN Shengwei1 ZHU Ming1 ZHENG Jinxiu1 CHEN Daoli1

1.Maanshan Center for Disease Control and Prevention in Anhui Province, Maanshan 243000, China; 2. Medical College of Dongnan University, Nanjing 210009, China

[Abstract] Objective To investigate the EV71 genotypes in 3 cities of the middle and lower reaches of Changjiang River. Methods EV71 RNA was detected in 143 samples from the hospitals with reverse translation polymerase chain reaction. Results There were 33 (23%) positive products. After the 33 positive products were sequenced, the results showed that they were all C4 genotype EV71. Conclusion It seems that the HFMDs are mainly infected by the C4 genotype EV71 in these areas. This study indicates that the current C4 genotype EV71 varied significantly in different cities.

[Key words] EV71; RT-PCR; Hand-foot-mouth disease; Genotype

人类肠道病毒71 型（EV71）属于肠病毒属A型，是柯萨奇病毒A16（CA16）的近亲, 其感染后主要引起手足口病（hand-foot-mouth disease, HFMD）、疱疹性咽峡炎、无菌性脑膜炎及脑炎等临床症状。EV71急性感染还容易造成严重的神经系统疾病，重症病人病死率可达10%～25%，这一点与CA16不同[1]。1997年以来，EV71病毒的流行在亚太地区呈明显上升趋势。其中，1998年和2000年台湾有过两次EV71大流行，分别有129 106和80 677人染病，78、41人死亡[2]。我国深圳2003年也出现EV71暴发疫情[3]，2008年3～4月间我省阜阳市发生儿童感染EV71疫情，死亡总人数达到36人[4]。

有研究利用VP1序列的差异对EV71型病毒进行的一项分子流行病学调查发现[5]，EV71型病毒又可分为A、B、C三个亚型。在亚型中，B型和C型又可以分成B1~B5和C1~C5。各地流行的EV71病毒株存在差异，1970年美国加利福尼亚分离出的EV71毒株属于A型；随后，美国、哥伦比亚及澳大利亚等地成功分离出EV71毒株的亚型EB型。1997～2000年，亚太地区流行的EV71属于B3、B4、C1和C2型[6]，而2008年安徽省阜阳市流行的毒株则为C4型。

为了了解长江中下游三城市EV71流行毒株的基因型别，我们通过RT-nPCR技术（逆转录-半巢式聚合酶链反应）对143个疑似手足口病的样本的咽拭子标本进行了检测，并对不同城市之间流行的毒株是否为同源毒株进行了分析。

1 材料与方法

1.1 一般材料

咽拭子标本共143份，来源于2012年5～7月安徽马鞍山市、芜湖市和南京市各医院收治的手足口病患儿。手足口病诊断标准依据《手足口病预防控制指南》（2008年版）。

1.2 EV71代表株的基因序列

在GenBank中查询13株EV71毒株的VP1序列，其中11株包括A、B、C型及其亚型，为部分基因序列。剩余2株为全基因序列。

1.3 引物的设计

以GenBank中的EV71基因序列为参照，通过不同的基因型以及亚型的保守区合成相关引物。具体引物序列如下：第一轮：5-CCRGTAGGKGTRC ACGCRAC-3， 5-GTTCTTAACTCACATAGCA-3；第二轮：5-TTGACAAAAACTGAGGGGTT-3，5-GTTCTTAACTC ACATAGCA-3。由于引物位于EV71 的VP1区域，所以能更加有效地扩增EV71 A、B、C亚型的基因片段[7]。

1.4 RNA抽提及半巢氏RT-PCR检测

取200 μL咽拭子按照Rneasy Mini Kit（Qiagen）中提到的操作说明进行病毒RNA的提取。所提取RNA于-70℃进行保存或者立刻进行反转录实验。以阴性作为实验对照，RT-PCR反应采用一步法RT-PCR试剂盒（Qiagen）进行扩增。第一轮的反应环境为：42℃下逆转录（45 min），94℃下预变性（4 min）；第一轮的PCR反应环境：94℃下变性（30 s），50℃下退火（25 s），72℃下延伸（70 s），一共35个循环周期；72℃下再延伸（10 min）。第二轮的PCR反应温度依次为：50℃（30 min），94℃（2 min），94℃（30 s），48℃（30 s），72℃（40 s），一共35个循环周期。

1.5 测序与分析

通过纯化试剂盒对PCR阳性产物进行测序，该过程由上海英骏生物公司完成。利用分子生物学软件MEGA4.1和DNASTAR进行序列的遗传距离计算、同源性比较以及基因的进化树绘制，方法参照相关文献[8]。

2 结果

2.1 EV71 RNA的检测

对三个城市临床诊断为手足口病患儿的143份咽拭子标本进行EV71病毒的 RNA检测。结果显示共有33份阳性标本，阳性率为31%。部分阳性标本的PCR产物的电泳图谱见图1。

1. DNA分子量标准；2. 阴性对照；3. MAS-01；4. MAS-12；

endprint

5.WUHU-01；6.NANJING-05

图1 马鞍山地区标本的PCR产物电泳图

2.2 同源性分析

将33份纯化后的阳性标本的核苷酸序列与EV71病毒各基因型和亚型代表株的相应片段进行同源性比较（表1）。33株EV71病毒分离株与 CA16、A、B 基因型及亚型代表株的同源性差异较大，与CA16代表株核苷酸同源性仅为49.2%～53.4%，与C代表株同源性差异较小，为82.6%～98.6%。与 B基因型及其亚型代表株的同源性为78.1%～81.4%，与A代表株（U22521）的同源性为75.0%～79.3%;与C4基因亚型同源性最高，达92.1%～98.6%。马鞍山12株内部同源性最高，达到99.5%～100%，南京11株内部同源性为96.5%～100%，而芜湖10株同源性为96.3%～100%。三城市之间毒株比较发现，马鞍山与南京毒株间的同源性在92.5%～94.7%之间；马鞍山与芜湖毒株间的同源性较高，为96.3%～100%；而南京、芜湖毒株间的同源性最低，仅为89.8%～94.1%。

2.3基因分型

从基因进化树（图2）可以看到，CA16 U05876毒株单独成一分支，EV71 A型U22521株构成一个主要分支；AF376066、AF376117、U22522、AY905548、AY135873株则分别构成B1~B5亚型；33例阳性标本与来源于新加坡、台湾及阜阳的6个毒株形成一个分支，该分支较大。上述结果提示，33份标本属于C型EV71病毒，同时和阜阳EU703812毒株形成同一亚型，为EV71 C4b病毒。C型EV71分支中可继续分为5个亚型。其中AF135948 和AB552988共同形成一个亚型，为亚型C2。AF135932独自形成一个亚型，为亚型C1；阜阳株和我们的研究中发现的33株组成一个分支，为亚型C4。

3 讨论

1969年EV71病毒首次从一名患有中枢神经系统疾病的婴儿中分离出。此后全球范围内均有EV71病毒的相关流行报道。过去40多年间，共三次全球大流行。其中，我国台湾地区于1998年发生了HFMD的大流行，共出现病例为129 106例，其中严重病例405例，死亡78例，大部分死因为肺水肿和肺出血，其中＜5岁的死亡患儿占91％，其中48.7%的患者感染EV71[2]。

由于HFMD主要由EV71 和 CVA16 引起，但两者临床症状类似，难以区分，因此主要依靠实验室诊断。目前实验室常规诊断方法主要有免疫组化、病毒分离及中和抗体水平的检测。然而，这些方法需较大人力、物力及时间，无法满足快速诊断和大样本的显示需求。研究表明[9]肠道病毒（EV）的血清型与VP1基因序列密切相关，可用于鉴定 EV血清型；同时由于其存在最大的变异率，因此研究人员利用这一点对EV病毒进行相关的分子流行病学研究。

本研究以EV71病毒特异性片段为引物，扩增出 EV71 VP1区232bp的基因片段，从而达到快速诊断目的。本研究对143份咽拭子标本进行了扩增，其中33份标本的PCR结果为阳性。同时，课题组对33株EV71病毒的特异性序列进行了相关的基因进化分析。实验结果表明33株病毒与 A型及B型代表株存在较大差异，而与 C型代表株存在较高的同源性，尤其与属于C4亚型毒株有很高同源性。

以往研究认为各毒株基因型内部的差异＞15%视

为一个新的基因型，而同源性＜12％为亚型分型的标准[9]。实验中所分离的33株EV7病毒与C型病毒有82.6%～98.6%的同源性序列。因此根据上述标准，应该出现新的病毒型或病毒亚型。然而从基因树的结果进行分析，33株病毒依旧为C型病毒。造成该现象发生的可能原因为：PCR扩增的序列片段较小，造成有较大差异的同源性现象的形成。当前国内对EV71的检测研究所扩增的序列均为200～350 bp。因此，继续以之前的分型标准进行病毒分型值得商榷。

根据基因同源性的结果，我们发现33株EV71分离株虽然均属于C4亚型，但不同城市所分离的毒株同源性并不高，存在较大变异。因此，对EV71分子流行病学进行深入的研究有利于我们研制特异性强、灵敏度高的诊断试剂和EV71疫苗。

[参考文献]

[1]周晓凤，熊林. 重症手足口病并发脑炎患儿的护理干预[J]. 中国现代医生， 2013，51（15）：98-99.

[2]Ho M，Chen ER，Hsu KH，et al. An epidemic of enterovirus 71 infection in Taiwan[J]. N Engl J Med，1999，341（13）：929-935.

[3]仇桂华，何燕平，刘艺颍，等. 重症手足口病（EV71感染）并发神经源性肺水肿患儿的急救与护理[J]. 安徽医学，2008，29（4）：367-368.

[4]姜青松. 郑州市二七区2009年手足口病流行病学分析[J]. 中国现代医生，2011，49 （8）：113-114.

[5]Brown BA，Oberste MS，Alexander JP，et a1. Molecular epi- demiology and evolution of entero- virus 71 strains isolated from 1970 to 1998 [J]. Virol，1999，73（12）：9969-9975.

[6]王美芬，陈韬杜，曾庆，等. 2010年昆明及周边地区普通型与重型手足口病病原学分析[J]. 中国实用医刊，2013， 40（1）：30-32.

[7]崔爱利，许文波，李秀珠，等. 肠道病毒71型的RT-PCR诊断及基因特征[J]. 病毒学报， 2004，20（2）：160-165.

[8]陈国兵，孟继鸿. 戊型肝炎病毒摩洛哥株非编码区基因序列鉴定及基因型分型[J]. 中华微生物学和免疫学杂志，2004，24（10）：828-833.

[9]张颖，和鹏，陈纯，等. 广州市2011年柯萨奇病毒A组6型的分子流行病学特征[J]. 中华流行病学杂志，2014， 35（1）：103-104.

（收稿日期：2014-03-26）

endprint

5.WUHU-01；6.NANJING-05

图1 马鞍山地区标本的PCR产物电泳图

2.2 同源性分析

将33份纯化后的阳性标本的核苷酸序列与EV71病毒各基因型和亚型代表株的相应片段进行同源性比较（表1）。33株EV71病毒分离株与 CA16、A、B 基因型及亚型代表株的同源性差异较大，与CA16代表株核苷酸同源性仅为49.2%～53.4%，与C代表株同源性差异较小，为82.6%～98.6%。与 B基因型及其亚型代表株的同源性为78.1%～81.4%，与A代表株（U22521）的同源性为75.0%～79.3%;与C4基因亚型同源性最高，达92.1%～98.6%。马鞍山12株内部同源性最高，达到99.5%～100%，南京11株内部同源性为96.5%～100%，而芜湖10株同源性为96.3%～100%。三城市之间毒株比较发现，马鞍山与南京毒株间的同源性在92.5%～94.7%之间；马鞍山与芜湖毒株间的同源性较高，为96.3%～100%；而南京、芜湖毒株间的同源性最低，仅为89.8%～94.1%。

2.3基因分型

从基因进化树（图2）可以看到，CA16 U05876毒株单独成一分支，EV71 A型U22521株构成一个主要分支；AF376066、AF376117、U22522、AY905548、AY135873株则分别构成B1~B5亚型；33例阳性标本与来源于新加坡、台湾及阜阳的6个毒株形成一个分支，该分支较大。上述结果提示，33份标本属于C型EV71病毒，同时和阜阳EU703812毒株形成同一亚型，为EV71 C4b病毒。C型EV71分支中可继续分为5个亚型。其中AF135948 和AB552988共同形成一个亚型，为亚型C2。AF135932独自形成一个亚型，为亚型C1；阜阳株和我们的研究中发现的33株组成一个分支，为亚型C4。

3 讨论

1969年EV71病毒首次从一名患有中枢神经系统疾病的婴儿中分离出。此后全球范围内均有EV71病毒的相关流行报道。过去40多年间，共三次全球大流行。其中，我国台湾地区于1998年发生了HFMD的大流行，共出现病例为129 106例，其中严重病例405例，死亡78例，大部分死因为肺水肿和肺出血，其中＜5岁的死亡患儿占91％，其中48.7%的患者感染EV71[2]。

由于HFMD主要由EV71 和 CVA16 引起，但两者临床症状类似，难以区分，因此主要依靠实验室诊断。目前实验室常规诊断方法主要有免疫组化、病毒分离及中和抗体水平的检测。然而，这些方法需较大人力、物力及时间，无法满足快速诊断和大样本的显示需求。研究表明[9]肠道病毒（EV）的血清型与VP1基因序列密切相关，可用于鉴定 EV血清型；同时由于其存在最大的变异率，因此研究人员利用这一点对EV病毒进行相关的分子流行病学研究。

本研究以EV71病毒特异性片段为引物，扩增出 EV71 VP1区232bp的基因片段，从而达到快速诊断目的。本研究对143份咽拭子标本进行了扩增，其中33份标本的PCR结果为阳性。同时，课题组对33株EV71病毒的特异性序列进行了相关的基因进化分析。实验结果表明33株病毒与 A型及B型代表株存在较大差异，而与 C型代表株存在较高的同源性，尤其与属于C4亚型毒株有很高同源性。

以往研究认为各毒株基因型内部的差异＞15%视

为一个新的基因型，而同源性＜12％为亚型分型的标准[9]。实验中所分离的33株EV7病毒与C型病毒有82.6%～98.6%的同源性序列。因此根据上述标准，应该出现新的病毒型或病毒亚型。然而从基因树的结果进行分析，33株病毒依旧为C型病毒。造成该现象发生的可能原因为：PCR扩增的序列片段较小，造成有较大差异的同源性现象的形成。当前国内对EV71的检测研究所扩增的序列均为200～350 bp。因此，继续以之前的分型标准进行病毒分型值得商榷。

根据基因同源性的结果，我们发现33株EV71分离株虽然均属于C4亚型，但不同城市所分离的毒株同源性并不高，存在较大变异。因此，对EV71分子流行病学进行深入的研究有利于我们研制特异性强、灵敏度高的诊断试剂和EV71疫苗。

[参考文献]

[1]周晓凤，熊林. 重症手足口病并发脑炎患儿的护理干预[J]. 中国现代医生， 2013，51（15）：98-99.

[2]Ho M，Chen ER，Hsu KH，et al. An epidemic of enterovirus 71 infection in Taiwan[J]. N Engl J Med，1999，341（13）：929-935.

[3]仇桂华，何燕平，刘艺颍，等. 重症手足口病（EV71感染）并发神经源性肺水肿患儿的急救与护理[J]. 安徽医学，2008，29（4）：367-368.

[4]姜青松. 郑州市二七区2009年手足口病流行病学分析[J]. 中国现代医生，2011，49 （8）：113-114.

[5]Brown BA，Oberste MS，Alexander JP，et a1. Molecular epi- demiology and evolution of entero- virus 71 strains isolated from 1970 to 1998 [J]. Virol，1999，73（12）：9969-9975.

[6]王美芬，陈韬杜，曾庆，等. 2010年昆明及周边地区普通型与重型手足口病病原学分析[J]. 中国实用医刊，2013， 40（1）：30-32.

[7]崔爱利，许文波，李秀珠，等. 肠道病毒71型的RT-PCR诊断及基因特征[J]. 病毒学报， 2004，20（2）：160-165.

[8]陈国兵，孟继鸿. 戊型肝炎病毒摩洛哥株非编码区基因序列鉴定及基因型分型[J]. 中华微生物学和免疫学杂志，2004，24（10）：828-833.

[9]张颖，和鹏，陈纯，等. 广州市2011年柯萨奇病毒A组6型的分子流行病学特征[J]. 中华流行病学杂志，2014， 35（1）：103-104.

（收稿日期：2014-03-26）

endprint

5.WUHU-01；6.NANJING-05

图1 马鞍山地区标本的PCR产物电泳图

2.2 同源性分析

将33份纯化后的阳性标本的核苷酸序列与EV71病毒各基因型和亚型代表株的相应片段进行同源性比较（表1）。33株EV71病毒分离株与 CA16、A、B 基因型及亚型代表株的同源性差异较大，与CA16代表株核苷酸同源性仅为49.2%～53.4%，与C代表株同源性差异较小，为82.6%～98.6%。与 B基因型及其亚型代表株的同源性为78.1%～81.4%，与A代表株（U22521）的同源性为75.0%～79.3%;与C4基因亚型同源性最高，达92.1%～98.6%。马鞍山12株内部同源性最高，达到99.5%～100%，南京11株内部同源性为96.5%～100%，而芜湖10株同源性为96.3%～100%。三城市之间毒株比较发现，马鞍山与南京毒株间的同源性在92.5%～94.7%之间；马鞍山与芜湖毒株间的同源性较高，为96.3%～100%；而南京、芜湖毒株间的同源性最低，仅为89.8%～94.1%。

2.3基因分型

从基因进化树（图2）可以看到，CA16 U05876毒株单独成一分支，EV71 A型U22521株构成一个主要分支；AF376066、AF376117、U22522、AY905548、AY135873株则分别构成B1~B5亚型；33例阳性标本与来源于新加坡、台湾及阜阳的6个毒株形成一个分支，该分支较大。上述结果提示，33份标本属于C型EV71病毒，同时和阜阳EU703812毒株形成同一亚型，为EV71 C4b病毒。C型EV71分支中可继续分为5个亚型。其中AF135948 和AB552988共同形成一个亚型，为亚型C2。AF135932独自形成一个亚型，为亚型C1；阜阳株和我们的研究中发现的33株组成一个分支，为亚型C4。

3 讨论

1969年EV71病毒首次从一名患有中枢神经系统疾病的婴儿中分离出。此后全球范围内均有EV71病毒的相关流行报道。过去40多年间，共三次全球大流行。其中，我国台湾地区于1998年发生了HFMD的大流行，共出现病例为129 106例，其中严重病例405例，死亡78例，大部分死因为肺水肿和肺出血，其中＜5岁的死亡患儿占91％，其中48.7%的患者感染EV71[2]。

由于HFMD主要由EV71 和 CVA16 引起，但两者临床症状类似，难以区分，因此主要依靠实验室诊断。目前实验室常规诊断方法主要有免疫组化、病毒分离及中和抗体水平的检测。然而，这些方法需较大人力、物力及时间，无法满足快速诊断和大样本的显示需求。研究表明[9]肠道病毒（EV）的血清型与VP1基因序列密切相关，可用于鉴定 EV血清型；同时由于其存在最大的变异率，因此研究人员利用这一点对EV病毒进行相关的分子流行病学研究。

本研究以EV71病毒特异性片段为引物，扩增出 EV71 VP1区232bp的基因片段，从而达到快速诊断目的。本研究对143份咽拭子标本进行了扩增，其中33份标本的PCR结果为阳性。同时，课题组对33株EV71病毒的特异性序列进行了相关的基因进化分析。实验结果表明33株病毒与 A型及B型代表株存在较大差异，而与 C型代表株存在较高的同源性，尤其与属于C4亚型毒株有很高同源性。

以往研究认为各毒株基因型内部的差异＞15%视

为一个新的基因型，而同源性＜12％为亚型分型的标准[9]。实验中所分离的33株EV7病毒与C型病毒有82.6%～98.6%的同源性序列。因此根据上述标准，应该出现新的病毒型或病毒亚型。然而从基因树的结果进行分析，33株病毒依旧为C型病毒。造成该现象发生的可能原因为：PCR扩增的序列片段较小，造成有较大差异的同源性现象的形成。当前国内对EV71的检测研究所扩增的序列均为200～350 bp。因此，继续以之前的分型标准进行病毒分型值得商榷。

根据基因同源性的结果，我们发现33株EV71分离株虽然均属于C4亚型，但不同城市所分离的毒株同源性并不高，存在较大变异。因此，对EV71分子流行病学进行深入的研究有利于我们研制特异性强、灵敏度高的诊断试剂和EV71疫苗。

[参考文献]

[1]周晓凤，熊林. 重症手足口病并发脑炎患儿的护理干预[J]. 中国现代医生， 2013，51（15）：98-99.

[2]Ho M，Chen ER，Hsu KH，et al. An epidemic of enterovirus 71 infection in Taiwan[J]. N Engl J Med，1999，341（13）：929-935.

[3]仇桂华，何燕平，刘艺颍，等. 重症手足口病（EV71感染）并发神经源性肺水肿患儿的急救与护理[J]. 安徽医学，2008，29（4）：367-368.

[4]姜青松. 郑州市二七区2009年手足口病流行病学分析[J]. 中国现代医生，2011，49 （8）：113-114.

[5]Brown BA，Oberste MS，Alexander JP，et a1. Molecular epi- demiology and evolution of entero- virus 71 strains isolated from 1970 to 1998 [J]. Virol，1999，73（12）：9969-9975.

[6]王美芬，陈韬杜，曾庆，等. 2010年昆明及周边地区普通型与重型手足口病病原学分析[J]. 中国实用医刊，2013， 40（1）：30-32.

[7]崔爱利，许文波，李秀珠，等. 肠道病毒71型的RT-PCR诊断及基因特征[J]. 病毒学报， 2004，20（2）：160-165.

[8]陈国兵，孟继鸿. 戊型肝炎病毒摩洛哥株非编码区基因序列鉴定及基因型分型[J]. 中华微生物学和免疫学杂志，2004，24（10）：828-833.

[9]张颖，和鹏，陈纯，等. 广州市2011年柯萨奇病毒A组6型的分子流行病学特征[J]. 中华流行病学杂志，2014， 35（1）：103-104.

（收稿日期：2014-03-26）

endprint