非必需氨基酸和β-巯基乙醇对神经干细胞增殖的影响

王娓娓，鲍天昊,2，张红苗，王淑芬，肖志成， 韩剑虹

(1昆明医科大学第二附属医院,昆明650101；2昆明医科大学附属精神卫生中心；3昆明医科大学)



非必需氨基酸和β-巯基乙醇对神经干细胞增殖的影响

王娓娓1，鲍天昊1,2，张红苗1，王淑芬3，肖志成3， 韩剑虹1

(1昆明医科大学第二附属医院,昆明650101；2昆明医科大学附属精神卫生中心；3昆明医科大学)

摘要：目的观察非必需氨基酸(NEAA)和β-巯基乙醇对神经干细胞(NSCs)增殖的影响。方法 取孕龄为14.5 d的雌鼠，处死后提取NSCs并培养，取5～7代的NSCs用于实验，将NSCs细胞使用传代培养基培养，并分为四组，对照组:加入磷酸盐缓冲液(PBS) 12 μL；NEAA组:加入NEAA 10 μL，PBS 2 μL；β-巯基乙醇组:加入β-巯基乙醇2 μL, PBS 10 μL；NEAA+β-巯基乙醇组:加入NEAA 10 μL,β-巯基乙醇2 μL。通过细胞计数法计算NSCs的增殖速度，噻唑蓝(MTT)法测定NSCs增殖率，RT-PCR法测定NSCs中凋亡相关基因含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)的表达，免疫组化法对NSCs进行鉴定并测定NSCs向神经元和星形胶质细胞的分化潜能。结果与对照组比较，NEAA组NSCs增殖速度、增殖率升高，Caspase-3 mRNA降低(P<0.05或<0.01)；β-巯基乙醇组及NEAA+β-巯基乙醇组NSCs增殖速度、增殖率升高，Caspase-3 mRNA、TUJ-1阳性细胞百分比、GFAP阳性细胞百分比降低，Nestin升高(P<0.05或< 0.01)。与NEAA组比较，NEAA+β-巯基乙醇组各项指标差异均有统计学意义(P<0.05或<0.01)；与β-巯基乙醇组比较，NEAA+β-巯基乙醇组NSCs增殖速度、增殖率升高，Caspase-3 mRNA降低(P<0.05或<0.01)。结论 NEAA和β-巯基乙醇均能促进NSCs增殖，联合使用起协同作用。

关键词：神经干细胞；非必需氨基酸；β-巯基乙醇；增殖；分化

神经干细胞(NSCs)广泛存在于胚胎和成年哺乳动物中枢神经系统,是一类具有分裂潜能和自我更新能力的前体细胞，它可以通过对称分裂和不对称分裂方式进行自我更新并产生神经组织的各类细胞，包括神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等[1]。NSCs的发现为神经系统变性、损伤性疾病的修复、治疗开辟了新途径。已有研究表明，非必需氨基酸(NEAA)和β-巯基乙醇能够促进小鼠胚胎干细胞向NSCs转化[2]，但目前尚无NEAA和β-巯基乙醇对孕14.5 d来源胎鼠的NSCs作用的相关报道。本文进行了相关探讨。

1 材料与方法

1.1材料实验动物：孕14.5 d雌鼠购于昆明医科大学实验动物中心，合格证号: SCXY(滇)-2014004。试剂：达尔伯克改良伊格尔培养基- F12营养混合物 (DMEM-F12)培养基，神经基础培养基(Neuronal Base)，NEAA，β-巯基乙醇，青/链霉素(P/S)，谷氨酸混合物,0.05%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Trypsin-EDTA)，胎牛血清(FBS)，牛血清蛋白(BSA)均购自Gibco 公司。B27，噻唑蓝(MTT)购自Sigma公司。表皮细胞生长因子(EGF)，碱性纤维生长因子(bFGF)，巢蛋白(Nestin),神经元Ⅲ类β微管蛋白(TUJ-1)，胶质纤维酸性蛋白(GFAP)购自Millipore公司。PCR逆转录试剂盒购自宝生物工程有限公司，其他RT-PCR试剂购自ABI公司。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)及含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)基因引物由Invitrogen公司合成。GAPDH:F:5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′;R:5′-TTGGCTCCACCCTTCAAGTG-3′。Caspase-3:F:5′-ACCGATGTCGATGCAGCTAA-3′;R:5′-GGTGCGGTAGAGTAAGCATA-3′。

1.2培养基的配制NSCs原代培养基：向DMEM/F12培养基内加入2 mmol/L Gluta MAX, 2 mmol/L P/S, 4 mmol/L B27, 20 ng/mL EGF和20 ng/mL bFGF。NSCs传代培养不含P/S，其余与原代培养基相同。NSCs贴壁培养基：向DMEM/F12 培养基内加入 50% Neuronal Base、 1% BSA、2 mmol/L Gluta MAX、4 mmol/L B27、20 ng/mL EGF和 20 ng/mL bFGF。NSCs分化培养基：向DMEM/F12 培养基内加入 50% Neuronal Base、0.5 % FBS、2 mmol/L Gluta MAX、 4 mmol/L B27。

1.3小鼠NSCs的分离和培养取孕龄为14.5 d的雌鼠，三溴乙醇安乐死后无菌操作取出胎鼠前脑的侧脑室颗粒下层(SVZ)，剪碎，使用400 μL的0.05% Trypsin-EDTA于37 ℃消化10 min，每5分钟吹打1次，使用DMEM-F12培养基终止消化。将细胞悬液在12 000 g、4 ℃离心10 min，弃上清，使用1 mL NSCs原代培养基重悬细胞后将NSCs种于12孔板。体外培养7 d，NSCs会形成生长成熟的神经球，将生长成熟的神经球进行传代。具体操作:将神经球吸入到1.5 mL离心管，800 g、4 ℃离心5 min，弃上清，使用400 μL胰酶消化3 min，使用DMEM-F12培养基终止消化。将细胞悬液在800 g、4 ℃离心5 min，弃上清，使用NSCs传代培养基重悬细胞, 细胞计数,以2×105/孔将NSCs种于12孔板，每孔含传代培养基1 mL。传代的NSCs在体外培养3 d会形成成熟的神经球，继续将神经球传代。5～7代NSCs用于本实验。

1.4分组及NSCs的处理NSCs传代后以2×105/孔种于12孔板，分为四组，对照组:加入磷酸盐缓冲液(PBS) 12 μL；NEAA组:加入NEAA 10 μL，PBS 2 μL；β-巯基乙醇组:加入β-巯基乙醇2 μL, PBS 10 μL；NEAA+β-巯基乙醇组:加入NEAA 10 μL,β-巯基乙醇2 μL。NEAA浓度为1%，β-巯基乙醇浓度为0.1 mmol/L。NSCs以1.0×105/孔种于多聚鸟氨酸(0.01%)包被过的24孔板，每孔加入0.5 mL NSCs贴壁培养基，体外培养48 h，进行免疫组化染色，对NSCs鉴定。本试验所用细胞为传代5～7代的NSCs，所有细胞能染色Nestin,提示我们所用细胞为NSCs。

1.5 NSCs增殖速度的测算用于实验的NSCs使用传代培养基以2×105/孔种于12孔板,按分组给予处理(同1.4)，并悬浮培养。48 h后收集神经球，吹散，消化后使用血细胞计数器进行活细胞计数。增殖速度=48 h后收集的活细胞数/2×105。

1.6NSCs增殖率的测算采用MTT法。NSCs以0.1×105/孔种于多聚鸟氨酸(0.01%)包被过的96孔板，每孔加入0.2 mL NSCs贴壁培养基并按分组给予处理(同1.4)，体外培养48 h，加入5 mg/mL的MTT在37 ℃作用4 h，去除培养基，加入二甲基亚砜150 μL/孔，室温下摇床上孵育15 min，使用酶标仪(Turner BioSystems公司)450 nm测定吸光度(A值)。

1.7NSCs中Caspase-3 mRNA的检测采用RT-PCR法。用于实验的NSCs使用传代培养基培养，并进行分组及处理(同1.4)。48 h后收集神经球，加入总RNA抽提试剂，提取总RNA。其余步骤按试剂盒说明书进行。

1.8GFAP、Nestin阳性细胞数的测算采用免疫组化染色法。NSCs以0.5×105/孔种于多聚鸟氨酸(0.01%)包被过的24孔板，每孔加入0.5 mL NSCs分化培养基，体外培养7 d，进行免疫组化染色(TUJ-1、Nestin、GFAP)，对NSCs向神经元和星形胶质细胞分化比例进行测定。具体步骤按试剂盒说明操作,镜下观察，拍片。Image J软件计算阳性细胞所占百分比。

2结果

各组NSCs增殖速度、细胞增殖率、Caspase-3 mRNA、TUJ-1阳性细胞、GFAP阳性细胞、Nestin阳性细胞比较见表1。

表1　各组NSCs增殖速度、增殖率、Caspase-3 mRNA、TUJ-1阳性细胞、GFAP阳性细胞、Nestin阳性细胞比较

注：与对照组比较，*P< 0.05,**P< 0.01;与NEAA组比较，#P<0.05,##P<0.01；与β-巯基乙醇组比较，@P<0.05，@@P< 0.01。 3 讨论

近年随着我国人口的迅速老龄化，中枢神经系统退行性疾病日益增多。虽然目前已有研究报道利用NSCs移植治疗阿尔茨海默病、亨廷顿病、多发性硬化、中风、脊髓损伤等神经退行性疾病[3, 4]，但是NSCs移植治疗始终存在免疫排斥[5]和伦理学的挑战。1992年Reynolds等[6]从成年鼠的纹状体和海马中分离出NSCs, 确定在成熟的中枢神经系统有NSCs的存在。神经损伤后，通过内源性及外源性刺激，促进神经新生，即促进机体自身的NSCs增殖、分化以修复受损的组织是NSCs研究的主要目的[7]。寻找安全有效的药物来促进自体神经新生一直是NSCs研究者努力的方向。

本研究中我们选择孕14.5 d的雌鼠，提取其胎鼠的前脑SVZ区经胰酶消化后获得NSCs进行培养。如果雌鼠的孕期短于14 d，其胎鼠的脑发育差，脑体积小，脑组织不饱满，完整地提取胎鼠前脑的实验操作难度加大。更重要的是，由于发育时间短，胎龄过小的胎鼠脑提取出的NSCs数量少、质量差，难以长期传代。如果胎龄大于15 d，NSCs已经开始向神经元发育，NSCs的增殖能力差会影响实验结果，造成较大实验偏差。

细胞活性的高低可以反映细胞的增殖能力[8]。细胞增殖速度是衡量细胞增殖的另一项常用指标。本研究中NEAA+β-巯基乙醇组细胞增殖率及增殖速度最高，NEAA组及β-巯基乙醇组高于对照组。说明NEAA和β-巯基乙醇均具有促进NSCs增殖的作用，联合作用效果更佳。Caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶[9],其裂解活化直接导致细胞死亡[10]。本研究发现，1% NEAA和0.1 mmol/L β-巯基乙醇均可降低Caspase-3 mRNA表达，联合作用效果更强。提示NEAA和β-巯基乙醇均具有抑制NSCs细胞凋亡的作用。本研究中的β-巯基乙醇组及NEAA+β-巯基乙醇组TUJ-1、GFAP阳性细胞百分比均降低，Nestin阳性细胞百分比升高，以NEAA+β-巯基乙醇组为著，提示β-巯基乙醇具有抑制NSCs向神经元及星形胶质细胞分化的作用，以联合应用效果更佳。

参考文献：

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Effects of non-essential amino acids and β-mercaptoethanol on proliferation of neural stem cells

WANGWeiwei1,BAOTianhao,ZHANGHongmiao,WANGShufen,XIAOZhicheng,HANJianhong

(1TheSecondAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming650101,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of combined application of non-essential amino acids (NEAA) and β- mercaptoethanol on proliferation of neural stem cells (NSCs). MethodsThe female rats in the gestational age of 14.5 d were selected and executed to extract NSCs and cultivate. We took 5-7 generations of NSCs to do the experiments.The NSCs cultured were divided into four groups: the control group which was added with 12 μL phosphate buffer solution (PBS), the NEAA group which was added with 10 L NEAA and 2 L PBS, the β-mercaptoethanol group which was added with 2 μL β-mercaptoethanol and 10 L PBS, and the NEAA + β-mercaptoethanol group which was added with 10 L NEAA and 2 μL β-mercaptoethanol. The proliferation of NSCs was calculated by cytometry, the proliferation rate of NSCs was detected by MTT, the caspase-3 expression of NSCs was assayed by RT-PCR, and NSCs were identified and examined for the differentiation potential of NSCs into neurons and astrocytes by immunohistochemistry. ResultsCompared with the control group, the proliferation speed and rate of NSCs in the NEAA group were increased, but the caspase-3 mRNA expression of NSCs was decreased (P<0.05 or P<0.01); the proliferation speed and rate of NSCs were increased, but the caspase-3 mRNA expression of NSCs, the percentage of positive ATUJ-1 cells, the percentage of positive GFAP cells were decreased and Nestin was increased in the β-mercaptoethanol group and NEAA+β-mercaptoethanol group (P<0.05 or P<0.01). Significant difference was found in each index between the NEAA group and NEAA+β-mercaptoethanol group (P<0.05 or P<0.01).Compared with the β-mercaptoethanol group, the proliferation speed and rate of NSCs were increased, but the caspase-3 mRNA expression of NSCs was decreased in the NEAA+β-mercaptoethanol group (P<0.05 or P<0.01)ConclusionBoth NEAA and β-mercaptoethanol can promote the proliferation of neural stem cells and they have synergistic effect during the combined application.

Key words:neural stem cells; non-essential amino acids; β-mercaptoethanol; proliferation; differentiation

(收稿日期：2015-11-03)

中图分类号：R329.2

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)01-0021-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.01.007

通信作者简介：韩剑虹(1969-)，女，副教授，主要从事缺血性脑血管病研究。E-mail:hongjh8@126.com

作者简介：第一王娓娓(1982-)，女，讲师，主要从事老年病、心脑血管病及干细胞研究。E-mail:doctor_b@whu.edu.com

基金项目：国家自然科学基金资助项目(31460314)。