新型温度敏感水凝胶作为动脉瘤栓塞材料的初步研究

何亮，甄勇，张恒柱 ，宋炳伟 ，严正村，罗祺

(1.江苏省苏北人民医院 神经外科，江苏 扬州　225001; 2.吉林大学附属第一医院 神经外科，吉林 长春　130021)



新型温度敏感水凝胶作为动脉瘤栓塞材料的初步研究

何亮1，甄勇1，张恒柱1，宋炳伟1，严正村1，罗祺2

(1.江苏省苏北人民医院 神经外科，江苏 扬州225001; 2.吉林大学附属第一医院 神经外科，吉林 长春130021)

[摘要]目的:探讨微球- 壳聚糖/甘油磷酸钠水凝胶作为一种新型动脉瘤栓塞材料的可行性。方法:将壳聚糖/甘油磷酸钠溶液(1∶7)与海藻酸钠微球按不同比例混合，超声乳化、冰浴搅拌后，制成微球- 壳聚糖/甘油磷酸钠水凝胶，检测其pH值、成胶时间和力学强度，选择最佳配比；通过体外动脉瘤模型栓塞实验评价其导管内操控性和瘤内成胶性，通过兔耳中动脉栓塞实验评价其组织相容性。结果:当壳聚糖/甘油磷酸钠溶液与海藻酸钠微球体积比为1∶2时，所得水凝胶的pH值为7.28，成胶时间约2.5 min，最大应力在压缩应变为20%时已达到14 kPa，峰值可达25 kPa。体外动脉瘤模型栓塞过程中未出现溢胶现象，拔除微导管时亦未见有黏管或拉丝现象。兔耳中动脉栓塞后未出现组织排异反应；3 d后血管壁见少量炎症细胞浸润，1周时炎症反应达到高峰，3周后血管壁炎症细胞明显减少。结论:初步证实微球- 壳聚糖/甘油磷酸钠水凝胶是一种新型非黏附性组织工程材料，具有合适的pH值和成胶时间，良好的力学强度、操控性、瘤内成胶性和组织相容性，可用于动脉瘤栓塞。

[关键词]微球； 壳聚糖； 甘油磷酸盐； 水凝胶； 动脉瘤； 栓塞材料

颅内动脉瘤是脑动脉壁的异常膨出，可引起自发性蛛网膜下腔出血或脑内血肿，若治疗不当，致残病死率很高。目前治疗颅内动脉瘤的方法主要有开颅夹闭术和介入栓塞术，随着近年来栓塞材料的发展和介入技术的进步，血管内介入治疗已成为颅内动脉瘤治疗的首选方案[1]。但是，如何降低动脉瘤的再通率、减小复发风险，一直是困扰介入治疗的难题[2- 3]。利用组织工程材料促进动脉瘤颈部内皮细胞增生，达到动脉瘤的解剖学治愈，可能是解决这一难题的途径之一。本研究利用壳聚糖/甘油磷酸钠水凝胶的温度敏感性，加入不同比例的海藻酸钠微球，形成微球- 壳聚糖/甘油磷酸钠水凝胶，检测不同配比混合物的理化性质，并行体外动脉瘤模型栓塞和体内动脉栓塞实验，以期找到一种配比合适、可用于动脉瘤治疗的新型栓塞材料，为进一步研究创造条件。

1材料与方法

1.1材料

海藻酸钠微球(中科院长春应用化学研究所高分子物理与化学国家重点实验室，直径10~200 μm)、壳聚糖(沈阳国药集团，脱乙酰度90%)、甘油磷酸钠(瑞士Fluka公司)、Instron- 5869型材料试验机(美国Instron公司)、玻璃管动脉瘤模型(自制，大小约5 mm×4 mm)、中国大耳白兔(扬州大学动物实验中心提供，共6只，雌雄不限，体重2.5～3.0 kg)。

1.2方法

1.2.1新型温度敏感水凝胶的制备根据前期实验结果[4- 5]，制成壳聚糖/甘油磷酸钠体积比为1∶7的溶液(C- GP溶液)，将海藻酸钠微球按不同比例加入其中，超声乳化使其分散均匀，进行冰浴搅拌30 min后放入37 ℃水浴中形成凝胶。

1.2.2理化性能测试测定上面制备的不同配比水凝胶的pH值，用试管倒置法在37 ℃下观察其凝固时间，制成直径20 mm、高度15 mm的圆柱体，置于Instron- 5869型材料试验机下，测定其力学强度，测量3次，取平均值。

1.2.3体外动脉瘤模型栓塞在37 ℃静水水浴状态下，往微球- 壳聚糖/甘油磷酸钠水凝胶中加入适量显影剂钽粉，将微导管(echelon- 14)置入自制的玻璃管动脉瘤模型内，充盈保护球囊(Hyperglide)后缓慢推注水凝胶约0.2 ml，观察其操控性和瘤内成胶性。

1.2.4兔耳中动脉栓塞取中国大耳白兔6只，全麻成功后用手指压迫兔耳中动脉近端阻断血流，将0.2 ml 微球- 壳聚糖/甘油磷酸钠水凝胶缓缓注入双侧兔耳中动脉，待凝胶成形后松开手指观察局部血运情况，并于术后3天、1周、3周时各取2只制作兔耳中动脉病理切片，HE染色，观察水凝胶的组织相容性。

1.3统计学处理

2结果

2.1微球- 壳聚糖/甘油磷酸钠水凝胶理化性能测试结果

体积比为1∶7的壳聚糖/甘油磷酸钠溶液中加入不同比例的海藻酸钠微球后，随着微球含量的增加，混合物pH值呈十分平缓下降趋势(图1)。C- GP溶液与微球混合体积在1∶1~1∶4之间时，其对应的pH值波动于7.30~7.25之间，符合人体生理条件。试管倒置法在37 ℃下测得凝固时间随微球含量的增多而缩短(图2)，当C- GP溶液与微球混合体积比为1∶2时，凝固时间约2.5 min，符合导管操作体内快速成胶的时间要求，且较单纯C- GP溶液成胶时间明显缩短，差异有统计学意义(P<0.05)。将凝固成胶后的圆柱体，置于Instron- 5869型材料试验机下测定力学强度，随压缩应变的增大，最大应力先迅速增大后逐渐减小(图3)：当压缩应变达20%时，最大应力已达到14 kPa，可承受血流冲击；压缩应变达30%时，最大应力达到峰值，为25 kPa；之后，压缩应变进一步增大，最大应力缓慢减小，压缩应变达50%时，最大应力仍有16 kPa。

图1不同比例C- GP溶液与微球混合物pH值

图2不同比例C- GP溶液与微球混合物成胶时间(37 ℃)

图3微球- 聚壳糖/甘油磷酸钠复合物力学强度

2.2微球- 壳聚糖/甘油磷酸钠水凝胶体外动脉瘤模型栓塞实验结果

将C- GP溶液与微球体积比为1∶2的水凝胶经微导管缓慢推注至体外玻璃管动脉瘤模型内，约0.2 ml可完全充盈动脉瘤腔，水凝胶开始为半透明的淡黄色黏滞液体，聚集成团并逐渐凝固后成为乳白色凝胶(图4)；加入适量钽粉后，水凝胶具有X线可视性，可用于介入术中操控(图5)。拔除微导管时，未见有黏管或拉丝现象。

图437 ℃水浴下通过微导管在体外玻璃管动脉瘤模型内成胶

图5水凝胶加入钽粉后体外动脉瘤栓塞实验

2.3微球- 壳聚糖/甘油磷酸钠水凝胶兔耳中动脉栓塞实验结果

兔耳中动脉内缓缓注入微球- 壳聚糖/甘油磷酸钠水凝胶后，约2.5 min形成固态凝胶，松开压迫的手指，见局部动脉苍白、纤细，远端血管搏动消失，阻塞完全(图6)。栓塞后3 d，病理观察显示凝胶形态均匀，与血管分界清楚，管壁见少量炎症细胞浸润(图7)；1周时炎症反应达到高峰；3周后凝胶内有少量内皮细胞生长，与血管分界欠清，管壁内炎症细胞减少(图8)。

3讨论

目前治疗动脉瘤的最佳策略是利用组织工程材料，促进动脉瘤颈部组织增生，重建血管壁，从而达到动脉瘤的解剖学治愈，降低复发率[6- 7]。为达到此目标，开发一种既能达到致密栓塞，又能有助于动脉瘤颈部组织修复的液体栓塞材料十分关键。

图6水凝胶栓塞兔耳中动脉后局部动脉苍白，远端血管搏动消失

图7兔耳中动脉栓塞3 d后凝胶形态均匀，与血管分界清楚，管壁见少量炎症细胞浸润(HE ×200)

图8兔耳中动脉栓塞3周后凝胶内有少量内皮细胞生长，与血管分界欠清，管壁内炎症细胞减少(HE ×100)

壳聚糖(chitosan)是一种天然高分子材料，由自然界广泛存在的几丁质(chitin)经过脱乙酰作用而得到的，化学名为聚葡萄糖胺(1- 4)- 2- 氨基- B- D葡萄糖，具有良好的生物相容性、可降解性和安全性，在医药领域广泛用于止血、抗菌、调节免疫活性、调节内分泌、透析膜、人造骨和皮肤、药物载体等方面。壳聚糖只在酸性环境下保持溶液状态，pH值大于6.2时，其溶液开始出现沉淀[8]，但Chenite等[9]发现，加入弱碱性的甘油磷酸钠后，该系统可在室温下中性环境中保持液体状态，而在37 ℃时形成凝胶，此过程中无热量或其他物质产生，故可以加载细胞或其他大分子物质。同时，通过调整混合物中不同成分的配比，可以控制成胶时间。笔者所在团队前期的实验[4- 5]表明，随着甘油磷酸钠含量的增加，壳聚糖/甘油磷酸钠溶液凝胶时间缩短，当两者体积比为1∶7时，pH值为7.3，成胶时间约3.5 min，为较理想的配比；但此材料亦存在不足，如机械强度较低，当压缩应变达到40%时，最大应力才达到可承受血流冲击的14 kPa。

为改良壳聚糖/甘油磷酸钠溶液的理化特性，使其更适于动脉瘤的栓塞治疗，本研究在原有溶液中加入不同比例的海藻酸钠微球，制成微球- 壳聚糖/甘油磷酸钠水凝胶。海藻酸钠是一种天然多糖，具有良好的稳定性、溶解性、贴附性、黏性和安全性，有浓缩溶液、形成凝胶和成膜能力[10]。将海藻酸钠微球引入壳聚糖/甘油磷酸钠体系后，原有溶液的pH值稍有降低，但变化幅度很小(P>0.05)，仍处于人体生理范围内；成胶时间较原溶液明显缩短(P<0.05)，且随着微球含量的增加成胶速度进一步加快，当C- GP与微球体积比达1∶2时，约2.5 min即可成胶，符合导管操作体内快速成胶的时间要求。改良后的微球- 壳聚糖/甘油磷酸钠水凝胶，其机械强度较单纯C- GP溶液明显增强，压缩应变达20%时，最大应力已达到14 kPa，可承受血流冲击；最大应力峰值可达25 kPa，完全可以承受运动、咳嗽、高血压病等引起的血流变化，使栓塞后的动脉瘤更加稳定，复发率进一步降低。

在体外玻璃管动脉瘤模型栓塞实验中，保护球囊的应用，可临时封堵瘤颈口、阻断管内水流，使微导管内推注水凝胶时易于控制出胶的方向和速度，尽可能达到一次完全栓塞，并防止出现水凝胶的外溢造成异位栓塞；同时，新型水凝胶成胶迅速，2.5 min即形成固态凝胶，在组织缺血缺氧耐受时间窗内，符合临床操作的要求。体外动脉瘤栓塞实验证实微球- 壳聚糖/甘油磷酸钠水凝胶具有良好的原位成胶性，可达到一次完全栓塞，且栓塞过程中未出现溢胶现象，拔除微导管时亦未见有黏管或拉丝现象，非常适合介入操作。

在体内兔耳中动脉栓塞实验中，病理结果显示微球- 壳聚糖/甘油磷酸钠水凝胶具有良好的组织相容性，栓塞后未出现明显排异反应。固态凝胶起初形态均匀，与血管分界清楚，3周后部分凝胶降解，凝胶内有内皮细胞生长，符合最终通过血管内皮细胞生长封闭动脉瘤、达到解剖学治愈的要求。另外，动脉栓塞实验亦提示微球- 壳聚糖/甘油磷酸钠水凝胶具有一定的致炎性，但炎症反应程度轻，血管壁仅有少量炎症细胞浸润，且炎症反应时间较短，3周后血管壁内炎症细胞已较前明显减少。有文献报道，局部炎症反应与壳聚糖的脱乙酰度呈负相关[11]，即脱乙酰度越高，炎症反应程度越轻、持续时间越短。

本研究通过在壳聚糖/甘油磷酸钠溶液中加入不同比例的海藻酸钠微球，制成微球- 壳聚糖/甘油磷酸钠水凝胶，检测其pH值、成胶时间和力学强度，找到最佳配比，并在体外动脉瘤模型中观察其操控性和瘤内成胶性，在体内兔耳中动脉栓塞实验中观察其组织相容性，初步验证了此材料用于动脉瘤栓塞治疗的可行性。与原有温度敏感水凝胶相比，微球- 壳聚糖/甘油磷酸钠水凝胶具有成胶更快、机械强度更大的特点，而pH值变化不大，仍处于人体生理范围内，且操控性、瘤内成胶性、组织相容性良好，炎症反应轻，是一种新型动脉瘤栓塞材料，为下一步组织工程治疗动脉瘤创造了条件。

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The study of microspheres- chitosan/glycerophosphate hydrogel as the embolism meterial of aneurysms

HE Liang1，ZHEN Yong1，ZHANG Heng- zhu1，SONG Bing- wei1，YAN Zheng- cun1，LUO Qi2

(1.DepartmentofNeurosurgery，SubeiPeople’sHospitalofJiangsuProvince，Yangzhou225001，China;2.DepartmentofNeurosurgery，theFirstHospitalofJilinUniversity，Changchun130021，China)

[Abstract]Objective: To evaluate the feasibility of the injectable thermosetting microspheres- chitosan/glycerophosphate(M- C/GP) hydrogel as a new embolism meterial of aneurysms. Methods: Chitosan/glycerophosphate solution(1∶7) and sodium alginate microspheres were mixed in different volume ratios. The hydrogel of microspheres- chitosan/glycerophosphate(M- C/GP) was prepared by ultrasonic emulsification and ice bath stirring. The pH，colloidization time and mechanic strength of the hydrogel were detected respectively to determine the best ratio. The intracatheter manipulation and intratumoral gelation of the M- C/GP hydrogel was evaluated by embolizing aneurysm models. The tissue compatibility of the M- C/GP hydrogel was evaluated by embolizing rabbit ear arteries. Results: When the ratio of M- C/GP was 1∶2 at pH 7.28，the colloidization time was 2.5 minutes and the mechanic strength could reach 14 kPa at the compression strain of 20%，with the peak of 25 kPa. In the experiment of embolizing aneurysm models in vitro，the phenomenon of M- C/GP overflow was not observed during the embolizing，nor the phenomenon of M- C/GP colloghore during the drawing microcatheter. In the experiment of embolizing rabbit ear arteries in vivo，tissue rejection was not happened. A few of inflammatory cells were found in the vessel walls 3 days after embolizing rabbit ear arteries. The number of inflammatory cells was gradually increased in the peak in 1 week，and significantly reduced in 3 weeks. Conclusion: Preliminarily，M- C/GP can be a kind of new non- adhesion tissue engineering materials，with suitable pH，right colloidization time，better mechanical strength，intracatheter manipulation，intratumoral gelation and tissue compatibility，which can be used to embolize aneurysms．

[Key words]microspheres; chitosan; glycerophosphate; hydrogel； aneurysms； embolism materials

doi:10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.01．014

[中图分类号]R651.12

[文献标识码]A

[文章编号]1671- 6264(2016)01- 0063- 05

[通信作者]甄勇E- mail:panyu75@163.com

[作者简介]何亮(1982-)，男，江苏扬州人，主治医师，医学硕士。 E- mail:yzheliang@163.com

[基金项目]苏北人民医院院级基金资助项目(yzucms201323)

[收稿日期]2015- 06- 24[修回日期] 2015- 11- 14

[引文格式] 何亮，甄勇，张恒柱，等.新型温度敏感水凝胶作为动脉瘤栓塞材料的初步研究[J].东南大学学报:医学版，2016，35(1)：63- 67.

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